Cette méthode présente un moyen de créer des échafaudages dérivés de tissus indigènes qui peuvent être utilisés pour la régénération du cartilage. Le principal avantage de cette technique est que les composants du cartilage indigène sont conservés dans les échafaudages qui peuvent favoriser la formation et la régénération du cartilage in vitro et in vivo. Bien que ces méthodes utilisent le cartilage des articulations étouffantes équines, le cartilage de toutes les autres articulations peut être utilisé ainsi.
Pour commencer, obtenir une articulation cadavérique intacte pour l’isolement du cartilage et enlever l’excès de graisse de la peau et le tissu musculaire tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, définissez l’endroit où l’articulation s’articule en effectuant l’inflexion d’extension de l’articulation. Faire une incision horizontale pour atteindre la cavité articulaires.
Ensuite, faire une incision verticale pour ouvrir la zone articulaires. La cavité articulaires est remplie de liquide synovial qui coulera probablement de la cavité lors de l’exécution de l’incision correcte. Continuez à ouvrir complètement l’articulation en enlevant la graisse excessive, les muscles et les tendons, et en coupant à travers les tendons qui maintiennent l’articulation ensemble.
Inspecter soigneusement le cartilage pour déce faire état de dommages macroscopiques. Si le cartilage articulaire n’a pas un aspect lisse plus brillant ou si des preuves, cloques, fissures ou défauts sont présents, jetez le cartilage et recommencez. Utilisez un scalpel stérile pour enlever le cartilage de l’os.
Coupez jusqu’à l’os subchondral pour enlever le cartilage de la zone profonde. Recueillir les tranches de cartilage enlevées dans des tubes de 50 millilitres contenant une solution de lavage du cartilage préparée précédemment. Pendant le traitement, goutte à goutte régulière solution de lavage du cartilage sur le cartilage pour empêcher le cartilage de se dessécher.
Après avoir recueilli le cartilage de toutes les zones d’intérêt, casser congeler les tranches de cartilage dans l’azote liquide pendant cinq minutes. Transférer ensuite les tranches de cartilage en tubes de 50 millilitres et placer immédiatement les tranches congelées dans un séchoir à congélation. Lyophiliser les tranches de cartilage pendant 24 heures avec le séchoir à congélation.
Une fois terminé, conserver les tranches de cartilage lyophilisés dans un endroit sec à température ambiante. Pour le traitement manuel, pré-refroidir un mortier et un pilon avec de l’azote liquide, puis placer les tranches de cartilage lyophilisées dans le mortier et les submerger et l’azote liquide. Moudre directement les échantillons à la main pendant environ 45 minutes jusqu’à ce qu’ils soient suffisamment pulvérisés.
Alternativement, pour moudre les échantillons automatiquement à l’aide d’une machine à moudre, commencez par pré-refroidir le compartiment de broyage de la machine à moudre en ajoutant de l’azote liquide. Ajouter ensuite les tranches de cartilage lyophilisées et moudre l’échantillon à sa vitesse prédéfinie pendant quelques secondes jusqu’à une minute. Assurez-vous que toutes les particules sont au sol et qu’aucune particule ne reste au fond du compartiment de broyage.
Enfin, suivez la technique de décellularisation décrite dans le protocole texte qui l’accompagne avant de former des échafaudages. Transférer les particules de cartilage avec une petite étiquette dans un moule en plastique cylindrique. Presser toutes les bulles d’air pour éviter les caries dans l’échafaudage et remplir complètement le moule.
Pour éviter les caries dans les échafaudages, assurez-vous que les bulles d’air sont pressées tout en remplissant le moule avec des particules de cartilage. Après la formation, congeler le moule pendant 10 minutes à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, lyophiliser les échafaudages de cartilage dans le moule pendant 24 heures dans un séchoir à congélation.
Après lyophilisation, retirez soigneusement l’échafaudage du moule. Placez l’échafaud sous une longueur d’onde UV de 365 nanomètres et reliez-le pendant la nuit. Former des disques d’échafaudage en coupant les échafaudages stérilisés en tranches de trois millimètres d’épaisseur.
Transférer ensuite les échafaudages dans des puits séparés d’une plaque de six puits. Ajouter un millilitre de milieu d’expansion des chondrocytes sur les échafaudages et leur permettre de se réhydrater pendant 30 minutes. Pendant que les échafaudages se réhydratent, préparer les cellules et pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire préparée sur le dessus de l’échafaudage pré-trempé.
Puis incuber l’échafaud pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lors de l’utilisation de chondrocytes, assurez-vous qu’ils n’ont pas été élargis après le premier passage afin de minimiser le nombre de cellules différenciées. Après une heure, remettre l’assiette sur le capot de la culture et retourner soigneusement l’échafaudage.
Pipette les 50 autres microlitres de suspension cellulaire sur l’échafaudage et incuber pendant une autre heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter trois millilitres de milieu aux puits avec des échafaudages. Évitez de passer le milieu directement sur les échafaudages et manipulez doucement la plaque de culture pour éviter le décollement des cellules.
Retournez la plaque à l’incubateur et la cellule de culture a cédé des échafaudages à 37 degrés Celsius. Une combinaison de coloration historologique et de quantification d’ADN ont été employées pour montrer que les méthodes présentées dans cet article ont comme conséquence la décellularisation suffisante d’échafaudage de cartilage. Les échafaudages résultants se sont trouvés pour ne contenir aucune cellule avec des niveaux indétectables de l’ADN.
Ils manquent également de glycosaminoglycans et sont riches en collagène II.Here, formation de matrice néo est observée sur l’échafaudage cédé avec des cellules souches mésenchymales qui ont été cultivés pendant quatre semaines. La formation de glycosaminoglycans est abondante après quatre semaines. Après avoir tenté cette procédure, il est important d’examiner si la décellularisation a été couronnée de succès, avant de l’utiliser dans n’importe quelle application.
Après cette procédure, une analyse biochimique supplémentaire comme l’analyseur de taches occidentales peut être effectuée afin de répondre à des questions spécifiques sur la présence d’autres composants tels que les facteurs de croissance. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire afin d’explorer des stratégies de régénération du cartilage à l’aide de tissus décellulaires provenant de sources allogéniques et syngénéiques. Des précautions comme le port d’un manteau de laboratoire et de gants doivent toujours être prises.
