Ce travail a été financé par des subventions à SHO des National Institutes of Health (R01 GM092993), la National Science Foundation (NSF Career Award et DBI 0.964.216), l&#39;Office of Naval Research (ONR) Programme du jeune chercheur et le Prix du partenariat Minnesota pour la biotechnologie et génomique médicale. fabrication de l&#39;appareil a été réalisée à l&#39;Université du Minnesota nanofabrication Center (NFC), qui reçoit le soutien de la NSF à travers le Réseau National Nanotechnology Infrastructure. Ce travail a également été soutenue par des subventions à M. de la National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), la Applebaum, Hilton, Peterson et Sanford fondations et la famille McNeilus. Les auteurs tiennent à remercier Hyungsoon Im à l&#39;aide d&#39;illustrations et de Shailabh Kumar d&#39;assistance à la microscopie électronique à balayage.

1. Microfabrication de Microwell tableau Substrat <ol><li> Commencez avec une tranche de 4 pouces de silicium de 100 nm d&#39;oxyde à croissance thermique. </li><li> Spin SPR-955 0,7 résine photosensible sur la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes. </li><li> Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes. </li><li> Exposer résine photosensible. <ol><li> Utiliser un masque qui permettra de créer une um trous disposés suivant un réseau hexagonal avec une période de 3 um, où la matrice comprend une zone de 2 mm x 2 mm. </li><li> Exposer la plaquette à un photorépéteur en ligne en utilisant une taille de pas de 6 mm et d&#39;une exposition de 200 mJ / cm 2. </li></ol></li><li> Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes. </li><li> Développer l&#39;aide d&#39;un développeur de spin de déposer deux flaques de CD-26 sur la tranche pour une durée totale de développement de 90 sec. </li><li> Rincez abondamment à l&#39;eau ultra-pure de DI et sec avec N 2. </li><li> Graver l&#39;oxyde dans un graveur ionique réactive pour 6 min 50 sccm d&#39;Ar, 25 sccm de CF 4, et 50 sccm de CHF 3 floaile à une pression de 75 mTorr. </li><li> Graver le silicium dans une tranchée profonde ICP graveur ionique réactive pendant 2 min à 63 sccm de C 4 F 8, 27 sccm de SF6, 40 sccm d&#39;Ar et 10 sccm d&#39;O 2 qui s&#39;écoule à une pression de 14 mTorr. </li><li> Rincer à l&#39;acétone, le méthanol et l&#39;isopropanol pour éliminer résister. </li><li> Placer dans un bain de H 2 SO 4: H 2 O 2 01 heures 01 pendant 10 minutes pour nettoyer la surface. </li><li> Rincez abondamment à l&#39;eau ultra-pure de DI et sec avec N 2. </li><li> Déposer 1080 Å de Al 2 O 3 par dépôt de couches atomiques à 250 ° C. </li></ol> 2. Préparation de poly (diméthyl) Raclette <ol><li> Si possible, travailler en salle blanche. Travailler autrement dans l&#39;environnement le plus propre possible. </li><li> Obtenir un plat en plastique Petri (ou un autre récipient propre et jetable) avec ≥ 13 mm de côté. </li><li> Dans ce plat, verser 5 g d&#39;agent de durcissement PDMS, puis 50 g de PDMS base agent (ou quoi que ce soit avec un rapport de 1:10 qui la plupart du temps de remplir la boîte de Pétri). Mélanger soigneusement avec une pipette en plastique à usage unique ou d&#39;une tige. </li><li> Enlever les bulles en plaçant les PDMS mélangés dans une chambre avec une ligne de vide, le vide est appliqué jusqu&#39;à ce que les bulles sortent du mélange (environ 30 min). </li><li> S&#39;il n&#39;est pas déjà dans la boîte de Pétri, versez PDMS en boîte de Pétri, en évitant la création de bulles d&#39;air. </li><li> Cure nuit sur une plaque chauffante à&gt; 50 ° C (chaleur plus élevée pour moins de temps travaille aussi). </li><li> Avec la nouvelle lame propre / de rasoir, découpez soigneusement un morceau rectangulaire d&#39;environ 2,5 x 2,5 cm, en gardant surface supérieure aussi propre que possible. Peler avec une pince propres. Coupez un bord (jusqu&#39;à 1,5 cm) en appuyant sur la lame de rasoir en un seul mouvement, pour faire le bord supérieur aussi nette que possible (ce sera le bord utilisé dans le processus de raclette). </li><li> Nettoyez avec de l&#39;acétone, le méthanol, l&#39;alcool isopropylique et de l&#39;eau déminéralisée ultra-pure, puis sécher avec de l&#39;azote gazeux propre. Stocker dans une boîte de Petri propre. </li></ol> 3. Préparation de vésicules <ol><li> Recueillir lipidiques solutions de stockage de phosphatidylcholine à 25 mg / ml oeuf (PC) et 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) de sel d&#39;ammonium (Rho-DPPE) dans le chloroforme et un ml de solution à 0,5 mg / stock de monosialoganglioside GM1 dans le chloroforme / méthanol (2:1 v / v). </li><li> Dans un flacon de petit verre faire un mélange qui résulte en 97% en moles de PC, de 2% en moles GM1 et 1% en moles de Rho-DPPE en ajoutant 18,9 pi de 25 mg / ml de PC, 39,6 ul de 0,5 mg / ml GM1 et 7,9 ul d&#39; 1 mg / ml de Rho-DPPE en utilisant des seringues en verre. </li><li> Remarque:. Le matériel supplémentaire pour Nair et al 25 contient une excellente feuille de calcul Excel personnalisable pour calculer les quantités de lipides nécessaires à la création des vésicules de toute composition souhaitée. </li><li> Placer le flacon dans un dessiccateur à vide et éliminer le solvant en laissant le flacon sous vide pendant 6 heures. </li><li> Faire une solution aqueuse de 0,1M NaCl. Ajouter 0,5 ml de la solution 0,1 M de NaCl dans le flacon contenant le film lipidique séché. </li><li> Laisser le mélange de lipides aqueuse au repos pendant une nuit. </li><li> Brièvement mélange vortex pour créer une suspension de vésicules, suivi d&#39;une sonication pendant 20 min dans un bain de sonication à température ambiante. </li><li> Extruder la suspension de vésicules à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm de taille de pores. Passez la suspension de vésicules à travers le filtre de 17x. </li><li> Stocker les vésicules extrudes dans un flacon en verre à 4 ° C. </li></ol> 4. Formation de bicouches lipidiques sphériques pris en charge <ol><li> Recueillir 700 nm de diamètre SiO 2 perles. Les perles sont livrés dans de l&#39;eau distillée à une concentration de l&#39;action de 1,4 x 10 11 billes / ml. </li><li> Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml préparer une suspension de billes de 1 ml avec une concentration de 1,5 x 10 billes / ml 10 par addition de 107 ul de solution de langue bourrelet à 893 ul de 0,1 M de NaCl. </li><li> Vortex la suspension pour s&#39;assurer qu&#39;il est bien mixe. </li><li> Centrifuger la suspension à 1700 g pendant 20 min, puis jeter le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de 0,1 M de NaCl. Répétez cette étape deux fois plus de se laver les perles. </li><li> Pour former les SSLBs, dans un tube Eppendorf de 1,5 ml ajouter 25 ul de la suspension de billes de SiO 2 de 200 ul de 1 mg / ml de suspension de vésicules. Vortex le mélange et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. A ce stade, la concentration devrait être SSLB 1,7 x 10 9 / ml SSLBs. </li><li> Centrifugeuse à 1700 g pendant 20 min pour sédimenter les SSLBs. Le culot doit apparaître rose en raison de la rupture de vésicules avec Rho-DPPE sur les billes. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 225 ul de phosphate (PBS), pH = 7,4. Répétez les étapes 4.6 à 4.7 deux fois de plus pour enlever les vésicules non rompues de la suspension SSLB. </li></ol> 5. Assemblée des SSLB tableau <ol><li> Plaquette Cleave de réseaux de micro-puits résultant en morceaux rectangulaires avec 4-6 microrowell tableaux par pièce. </li><li> Vortex mélanger la suspension SSLB, puis placez 10 pi de SSLB suspension sur chaque réseau de puits. De peur reste pendant 1 heure pour permettre SSLBs pour régler à la surface. </li><li> Lavez délicatement la puce de réseau de micro-puits avec du PBS à partir d&#39;une bouteille de lavage, puis plonger dans un bain de PBS préparé dans un plat peu profond. </li><li> Bien que submergé, placez doucement la PDMS chasse raclette sur la puce de réseau de micro-puits et faites glisser doucement le long de la surface 5x pour enlever SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits. </li><li> Saisissez la puce de réseau de micropuits avec des pincettes et secouez-la délicatement dans le bain de PBS pour éliminer tout excès SSLBs. </li><li> Enlever rapidement la puce du bain raclette et placer dans un bain de PBS frais jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Assurez-vous que la surface supérieure de la puce reste humide pour préserver les SSLBs. </li></ol> Remarque: La méthode d&#39;assemblage décrite ci-dessus peut être utilisée pour créer des matrices de particules de membrane naturels, comme des particules de la myéline isolés à partir de cerveau de souris, ou phovésicules spholipid sans SiO 2 supports de perles. Ce travail est décrit en détail dans Wittenberg et al. 21 et des résultats représentatifs sont présentés ci-dessous. 6. Toxine cholérique essai de liaison <ol><li> Préparer une solution à 2 mg / ml d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS. </li><li> Préparer une solution à la concentration souhaitée de l&#39;Alexa 488 conjugué à la toxine cholérique sous-unité B dans du PBS avec 2 mg / ml de BSA. </li><li> Retirez la puce de réseau SSLB du bain de PBS et évacuer plus de la solution PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Laisser juste assez de PBS sur la puce de garder le tableau SSLB hydratée. </li><li> Pour éviter la liaison non spécifique, ajouter 200 ul de 2 mg / ml de solution de BSA à la puce de réseau SSLB. Laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée. </li><li> Avec une micropipette, enlever 200 pi de solution à partir du haut de la puce de réseau SSLB. </li><li> Ajouter 200 pi de solution de la toxine du choléra à la puce de réseau SSLB et laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée. </li><li> Lavez délicatement la puce de réseau SSLB avec du PBS à partir d&#39;une bouteille de lavage pour éliminer toute toxine cholérique non lié. </li><li> Wick l&#39;excès de PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Avant imagerie puce de couverture avec un glissement de 24 mm de couverture x 40 mm. </li><li> tableaux de l&#39;image avec un microscope droit en utilisant un filtre fixe approprié pour les fluorophores d&#39;intérêt. </li><li> Analyser l&#39;intensité de fluorescence de SSLBs individuels d&#39;un tableau à l&#39;aide de la fonction d&#39;analyse de particules automatisé de logiciels ImageJ. </li><li> Compiler intensités moyennes de SSLBs individuels de fluorescence en histogrammes qui résument les intensités des SSLBs trouvés sur un réseau donné. </li></ol>

<ol>
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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography.">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li><li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers.">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.

Dans ce travail, nous montrons que monodisperses SiO 2 perles enrobées avec les bicouches lipidiques en charge peuvent être disposés en rangées de puits de microtitration, sans la nécessité de ligands de ciblage sur les bicouches lipidiques ou la surface du substrat, et les matrices peuvent être utilisées pour la caractérisation des interactions de toxine-lipide. Le nous constante de dissociation calculée pour la liaison CTx/GM1 compare favorablement, compte tenu de la grande disparité des valeurs ...

Membranes bicouches lipidiques sont des structures essentielles dans la nature. Les membranes plasmiques et les membranes cellulaires des organites sont composées de bicouches lipidiques incorporant un certain nombre de molécules qui sont nécessaires à la vie. De nombreux procédés de survie se produisent sur la surface de cellules ou sont médiées par des molécules associées aux membranes bicouches de lipides. En fait, de nombreux procédés pharmaceutiques ou des molécules cibles se trouvent sur ​​ou dans les membranes 1,2. Il est donc nécessaire d&#39;étudier analytiquement les processus, tels que des réactions chimiques ou des événements de liaison non covalentes qui se produisent sur les surfaces de la membrane. Les membranes naturelles peuvent être difficiles à isoler et / ou l&#39;interface de capteurs, de nombreux chercheurs utilisent des membranes modèles simplifiés de réaliser des études analytiques. Un certain nombre de systèmes de membrane modèle sont décrits dans la littérature, allant de vésicules géantes qui peuvent être des dizaines à des centaines de microns de diamètre à des liposomes de dimensions nanométriques 3,4. Alterntivement, des bicouches lipidiques planes déposés sur des supports solides, à savoir, soutenus bicouches lipidiques (BLP), peuvent être formées sur un certain nombre de surfaces différentes et ont été largement utilisés dans des applications biophysiques, biochimiques et d&#39;analyse 5. Couplage BLP avec des matériaux électriques ou optiques permet l&#39;étude de la biochimie et de la biophysique de la membrane grâce à l&#39;utilisation de différentes techniques d&#39;analyse. Microscopie de fluorescence 6, 7 électrochimie, la spectroscopie optique 8, la microscopie à sonde de balayage 9, la résonance plasmonique de surface 10, et la spectrométrie de masse 11 ont tous été utilisés pour étudier la structure et les propriétés de BLP. Tableaux SLB offrent plus de polyvalence dans la conception de capteurs pour les essais multiplex 12,13. D&#39;autres applications utilisent des tableaux SLB pour imiter la jonction qui se forme entre les cellules immunitaires 14. Méthodes de préparation pour les tableaux SLB ont varié de microfluidic atteint près de 15 pour ceux qui emploient des barrières physiques entre les parcelles adjacentes SLB. 16 autres groupes ont utilisé des méthodes d&#39;impression 17, 18 et structuration photochimique diverses approches nanogénie 19 pour créer des tableaux SLB. Dans le présent document vidéo d&#39;accompagnement et nous démontrons une méthode pour former des réseaux par dépôt SLB SLB-SiO 2 revêtues perles en ensembles ordonnés de micropuits 20. Nous nous référons aux SLB-revêtus de SiO 2 perles en bicouches sphériques soutenues lipidiques (SSLBs). Cette technique est une extension des travaux antérieurs qui a créé des tableaux de vésicules de phospholipides et les membranes biologiques dérivés de sources naturelles 21, à partir de laquelle nous montrons aussi par exemple des résultats. D&#39;autres procédés pour rangeant particules de biomembrane ou vésicules se sont appuyés sur les modes de ligands de ciblage spécifiques sur des surfaces qui s&#39;associent avec des ligands complémentaires contenues sur la surface des vésicules. Les exemples incluent la biotineassociation avidine 22,23 et systèmes d&#39;hybridation d&#39;ADN 24. Notre approche ne nécessite qu&#39;un réseau de micro-puits sans ciblage ou de reconnaissance des groupements nécessaires. La taille de SSLBs est défini par le diamètre des supports de SiO 2 de perles, qui ont une faible poly-dispersité. En ajustant le diamètre de microtitration à un peu plus grand que le diamètre SSLB, un seul SSLB se dépose dans chaque micropuits. Un poly (diméthyl siloxane) (PDMS) racloir enlève ensuite la surface de tous les SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits. Les puits et les tableaux SSLB résultantes ont haute densité (~ 10 5 SSLBs / mm 2) avec 3 pm espacement centre à centre et la périodicité hexagonale. En déposant en série avec SSLBs compositions lipidiques différentes, il est possible de créer des tableaux à plusieurs composants avec SSLBs positionnées de manière aléatoire. Afin de démontrer la capacité de détection de réseaux SSLB, nous avons utilisé l&#39;interaction de la toxine cholérique (CTx) avec un ganglioside (GM1) incorporés dans les SSLBs. Avecparticules membranaires naturelles, nous avons pu détecter des lipides spécifiques des cellules dans des tableaux à plusieurs composants contenant des matières de la membrane à partir de deux types de cellules différents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

Membranes bicouches lipidiques forment les membranes plasmiques des cellules, et définissent les limites des organites subcellulaires. Dans la nature, ces membranes sont des mélanges hétérogènes de nombreux types de lipides, contiennent des protéines membranaires et sont décorées avec des hydrates de carbone. Dans certaines expériences, il est souhaitable de découpler les propriétés biophysiques et biochimiques de la bicouche lipidique de celles de la membrane naturelle. Ces cas nécessitent l&#39;utilisation de systèmes modèles tels que vésicules géantes, des liposomes ou des bicouches lipidiques supportées (BLP). Les tableaux de BLP sont particulièrement attrayants pour les applications de détection et imitant les interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour former des tableaux SLB. Submicronique diamètre SiO 2 perles sont d&#39;abord revêtus de bicouches lipidiques pour former BLP sphériques (SSLBs). Les billes sont ensuite déposés dans une matrice de micro-puits de micro-fabriqué sous-micron de diamètre. La technique de préparation utilise un &quot;raclette&quot; pour nettoyer la surface du substrat, tandis que leaving derrière SSLBs qui se sont installés dans des micropuits. Ce procédé ne nécessite aucune modification chimique du substrat de micropuits, ni aucun des ligands de ciblage particulier sur la SSLB. Les micropuits sont occupés par des billes uniques parce que le diamètre du puits est réglée pour être juste supérieur au diamètre du bourrelet. En règle générale, plus de 75% des puits sont occupés, tandis que le reste demeure vide. Dans tampon tableaux SSLB affichent une stabilité à long terme de plus d&#39;une semaine. Plusieurs types de SSLBs peuvent être placés dans un tableau unique par dépôt en série, et les matrices peuvent être utilisées pour la détection, dont on démontre par la caractérisation de l&#39;interaction de la toxine cholérique avec le ganglioside GM1. Nous montrons également que les vésicules de phospholipides sans supports de talon et des membranes biologiques à partir de sources cellulaires peuvent être disposés avec la même méthode et les lipides membranaires spécifiques de cellules peuvent être identifiées.

Lorsque des billes de SiO 2 sont mélangées avec une solution de vésicules composées de phospholipides, des lipides et d&#39;autres lipides fluorescents tels que les gangliosides, les vésicules se rompent sur ​​les surfaces de SiO 2 de talon pour former SSLBs, comme représenté schématiquement sur ​​la figure 1a. Après lavage des SSLBs, une goutte de solution SSLB est placé sur une matrice de micro-puits, et les billes sont laisse décanter à la surface....

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d&#39;analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K vues.  University of Minnesota.  Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles. ...

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Recherche

Bio-ingénierie

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Fabrication de puits d’Agarose personnalisé pour l’ensemencement de la cellule et l’anneau de tissu auto-assemblage à l’aide de moules 3D-imprimé

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.