This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.

1. Préparez à l&#39;avance <ol><li> Chaud stérile saline tamponnée phosphate (PBS) à 37 ° C. </li><li> Modification de Dulbecco chaud de milieu de Eagle (DMEM) et le milieu essentiel minimal (MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine à 37 ° C. Remarque: Ils représentent croissance normale Media (NGM) pour les cellules RAW et HeLa respectivement. </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> Cultiver les cellules RAW 264.7 à 70-90% de confluence dans NGM. <ol><li> Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d&#39;air / 5% de CO2 atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Cultiver les cellules HeLa à 70-90% de confluence dans NGM. <ol><li> Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d&#39;air / 5% de CO2 atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Avant le prélèvement, laver monocouche cellulaire une fois avec PBS stérile. </li><li> Recueillir des cellules pré-confluentes dans un tube conique stérile. <ol><li> Grattez délicatement les cellules RAWavec une spatule en caoutchouc dans du PBS, avec pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires. </li><li> Détacher les cellules HeLa avec une solution de trypsine à 0,25% jusqu&#39;en examen visuel montre une dissociation de la surface de culture. Par exemple, utiliser 2-3 ml pour un flacon T-75. Réglez le volume en conséquence pour assurer une solution de trypsine couvre toute la surface de croissance. <ol><li> Étancher réaction de dissociation avec NGM contenant 10% de FBS. </li><li> Utiliser au moins deux fois le volume de NGM à la trypsine, avec un pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires. </li></ol></li></ol></li><li> Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension dans même volume que solution de trypsine / de trempe en utilisant du PBS stérile. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de particules. </li><li> Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension dans un volume adéquat de solution PBS pendant 5,5 x 10 6 à 6,0 x 10 6 cellules / ml. Remarque: Par exemple, un flacon T-75 donnera Approximment 7,5 x 10 6 cellules 29. </li><li> Gardez la suspension de cellules sur la glace jusqu&#39;à l&#39;électroporation. </li></ol> 3. Préparation à électroporation <ol><li> Cuvettes pré-refroidissement électroporation (0,4 cm d&#39;écart) sur la glace. </li><li> Allumez appareil d&#39;électroporation et de régler la tension à 0,3 kV. REMARQUE: La capacité et la résistance ne étaient pas les paramètres réglables sur notre électroporateur (fixé à 10 pF et 600 Ω par le fabricant). </li><li> Remplissez plaques de recouvrement avec NGM et équilibrer dans l&#39;air humidifié / 5% de CO 2 atmosphère de 95% à 37 ° C </li></ol> 4. électroporation <ol><li> Placer 400 ul de suspension de cellules dans la cuve de pré-réfrigérés et ajouter 20 pg de protéine sélectionnée à cuvette (50 ug / ml). </li><li> Flick cuvette doucement à environ 10 fois pour mélanger sans endommager les cellules. Remarque: La cuvette peut aussi être inversé plusieurs fois pour bien mélanger, mais Ne pas pipeter de haut en bas ou vortex pour éviter d&#39;endommager les cellules. </li><li&gt; l&#39;extérieur sec de cuvette avec une serviette en papier ou autre glace pour éviter un arc électrique dans la électroporateur. </li><li> Échantillon électroporation à 0,3 kV pour 1.5 à 1.7 ms. Remarque: Ce était typique pour cette étude. </li><li> Immédiatement après l&#39;électroporation film cuvette doucement ~ 10 fois pour bien mélanger. </li></ol> 5. Placage des cellules <ol><li> cuvette de magasin avec des cellules électroporées sur la glace jusqu&#39;au moment de placer dans des plaques de recouvrement. </li><li> Pour la plupart des analyses en aval, laver les cellules avec 1x préchauffé NGM pour éliminer les protéines effectrices étrangère. <ol><li> Éliminer les cellules d&#39;analyse et de suspendre 3-5 ml de NGM. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension dans un volume adéquat de NGM pour la taille de la plaque désirée (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm). </li></ol></li><li> Retirer quantité appropriée de cellules pour l&#39;analyse en aval. <ol><li> Exemple 1: plaque dans des boîtes à fond de verre pour analyse au microscope. </li><li> Exemple 2: Plaque into plastique de culture de cellules pour l&#39;analyse des protéines telles que des purifications par affinité. </li></ol></li><li> Laisser les cellules de récupérer en plaques équilibrée dans humidifié 95% d&#39;air / 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° C pendant au moins 4 heures. </li></ol> 6. Microscopie Analyse 6.1) La fixation / coloration par immunofluorescence <ol><li> Laver les cellules avec du PBS 1x stérile après la période de récupération de 4 heures. </li><li> Fixer les cellules de methanol à 100% pendant 2 min à la température ambiante. Utiliser suffisamment de méthanol pour couvrir complètement cellules (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm). </li><li> Laver 3x avec PBS stérile. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre. <ol><li> Ajuster la longueur de perméabilisation et la force de Triton X-100 selon l&#39;épitope et la localisation de la protéine cible. Remarque: Les meilleurs résultats devront être déterminé de manière empirique pour chaque cible, mais les conditions ci-dessus doivent être adéquates pour la plupart cytosolic cibles. </li></ol></li><li> Bloquer avec 5% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre. </li><li> Laver 3x avec PBS. </li><li> Incuber anticorps primaire dans la solution de liaison d&#39;anticorps (0,1% de Triton X-100 et 1% de BSA dans du PBS) pendant une nuit à 4 &#160; ° C avec doux balancement. Par exemple, utiliser 0,5 ml pour une boîte de 35 mm de diamètre. <ol><li> Suivez les recommandations du fabricant pour l&#39;anticorps dilution. Remarque: Par exemple, l&#39;anticorps marqueur peptidique de liaison à la streptavidine (SBP-tag) a été utilisé à 1: 1000 dilution, tandis que l&#39;anticorps a été utilisé à PKN1 dilution 1: 200. </li></ol></li><li> Laver 4x avec PBS. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps approprié fluorescence conjugué secondaire en solution de liaison d&#39;anticorps pendant 1 heure à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. <ol><li> Par exemple, utiliser Alexa 488 ou Alexa 647 pendant 1 heure à température ambiante. <ol><li> Suivez les recommandations du fabricant pour antibody dilution. (Par exemple environ 1: 1000 pour la présente étude). </li></ol></li><li> Ajouter d&#39;autres taches, au besoin, par exemple, 5 uM germe de blé agglutinnin (WGA) conjugué à Alexa 647 ou DAPI selon les recommandations du fabricant, pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver 5x avec du PBS et conserver à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière jusqu&#39;au moment de l&#39;image. </li></ol> 6.2) microscopie confocale et analyse d&#39;images <ol><li> échantillons de l&#39;image sur un microscope confocal inversé en utilisant un objectif à immersion 63x d&#39;huile. <ol><li> canal vert d&#39;image en utilisant la ligne de 488 nm d&#39;un laser à l&#39;argon, avec une bande passante de 492 à 542 nm émission entre. </li><li> Image canal rouge utilisant une diode laser de 633 nm, avec une bande passante de 640 à 718 nm émission entre. </li><li> canal bleu de l&#39;image en utilisant une diode laser à 405 nm, avec une bande passante de 407 à 453 nm émission entre. </li><li> Assurer le canal multiples z piles couvrent l&#39;intégralité du volume cellulaire. </li></ol></li><li> Traiter les images avec un logiciel de traitement d&#39;image approprié. </li></ol> 7. Affinity Purification <ol><li> Laver les cellules électroporées deux fois avec 4 ° C PBS après la période de récupération de 4 heures. </li><li> Lyse à ~ 1,0 ml de tampon de lyse (1% de Triton X-100 avec un cocktail inhibiteur de protease et l&#39;inhibiteur de la phosphatase dans du PBS) sur de la glace. Utilisez inhibiteurs selon les instructions du fabricant. Remarque: Par exemple, à la fois les inhibiteurs de la protéase et la phosphatase utilisées dans cette étude ont été fournis à 100x, mais d&#39;autres formulations devraient fonctionner aussi bien. </li><li> Rapidement gratter cellules avec spatule en caoutchouc et de recueillir dans des tubes coniques. </li><li> Lyse par vortex vigoureux et sonication. Note: D&#39;autres méthodes de lyse peuvent travailler tout aussi bien, mais l&#39;efficacité devront être déterminée empiriquement quant à la pertinence des exigences de dosage. <ol><li> Sonication 3 x 30 s avec un vortex intermittent. </li></ol></li><li> Centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour recueillirdes débris cellulaires et des agrégats insolubles; sauver le surnageant. </li><li> Moissonneuse volumes égaux (~ 1,0 ml) de lysat de cellules à une électroporation avec 50 ul de streptavidine agarose suspension de résine à 4 ° C pendant une nuit avec rotation par rapport à l&#39;extrémité extrémité. Note: Cette résine capture la protéine électroporation (et complexes associés) par l&#39;intermédiaire de son peptide marqueur d&#39;affinité de liaison à la streptavidine. </li><li> Centrifuger à 2500 g pendant 2 min et éliminer le surnageant. </li><li> Laver deux fois avec 40 volumes de lit (~ 1 ml) PBS. </li><li> Ajouter 30 ul 4x LDS tampon de charge (141 mM de base Tris, 2% SI, 10% de glycerol, EDTA 0,51, 0,22 mM SERVA Bleu G, 0,175 mM de rouge de phénol, à pH 8,5), 20 ul diH 2 O, et 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), ce qui permet un certain volume pour rester en perles. </li><li> Chauffer à 95 ° C pendant 10 min et laisser refroidir sur glace. </li><li> Spin&gt; 10 000 xg à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Recueillir surnageant. </li><li> Effectuer un western blot utilisant des anticorps appropriés Remarque: Ilre, anticorps primaire anti-PKN1 est utilisé. </li></ol>

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E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Effecteurs sécrétée par les bactéries pathogènes ont évolué pour fonctionner dans l&#39;environnement de la cellule hôte et il est donc utile de les étudier in situ dans l&#39;hôte. Introduction d&#39;effecteurs spécifiques d&#39;intérêt dans des cellules hôtes permet les interactions pathogène-hôte pertinentes à étudier dans l&#39;isolement, sans interférence avec d&#39;autres protéines bactériennes. Le but était d&#39;explorer électroporation comme un moyen d&#39;introduire des protéin...

De nombreuses bactéries Gram-négatives utilisent des systèmes de sécrétion spécialisés pour injecter des protéines liées à la virulence (appelés effecteurs) directement dans les cellules hôtes 1-5. Ces effecteurs ont une large gamme de fonctions biologiques, notamment: la suppression de l&#39;immunité de l&#39;hôte, des modifications cytosquelettiques, la modification du trafic intracellulaire et la signalisation, les changements transcriptionnels et des altérations de protéasome hôte 9.6. Les fonctions d&#39;effecteurs certains sont connus, mais les cibles de l&#39;hôte et de l&#39;action biochimique (s) de nombreux autres restent à déterminer. En comparant de type sauvage et les infections bactériennes recombinantes est une approche valable pour étudier les mécanismes effecteurs de virulence intracellulaires, il est souvent avantageux d&#39;introduire un effecteur individu dans la cellule hôte. Ainsi, des méthodes simples pour l&#39;introduction et la caractérisation de protéines effectrices bactériennes dans le contexte de cellules hôtes est hautement souhaitable. Simplifier l&#39;analyse expérimentale wie un seul effecteur est essentiel que d&#39;autres effecteurs peuvent avoir des fonctions opposées ou redondantes. Pour réaliser cette simplification, les chercheurs ont déjà présenté des macromolécules dans des cellules par de nombreux procédés différents, y compris la transduction virale 10, la micro-injection 11, gratter chargement 12,13, la fusion cellulaire avec la micro-injection induite chimiquement 14, protéine de propriété «transfection» réactifs 15, des précipitations de phosphate de calcium 16, 17 à 20 et l&#39;électroporation. Les molécules introduites vont d&#39;acides nucléiques, y compris les espèces de l&#39;ADN, l&#39;ARN, les protéines et d&#39;ARNi, des colorants cellulaires imperméable, et des anticorps pour des cibles intracellulaires 21,22. Certaines méthodes ont des limites, y compris le type de macromolécule qui peut être introduite, et notamment des analyses en aval peuvent être limitées en raison de la toxicité élevée cellulaire, mécanismes dommageables d&#39;action, faible efficacité, ou l&#39;efficacité d&#39;introduction. Transfection, un ofteProcédé de n-utilisée pour l&#39;expression de gènes bactériens dans les cellules de mammifères, souffre également que la limitation de certains types de cellules hôtes appropriées, telles que les macrophages et les cellules primaires, sont particulièrement résistants à la transfection. Au-delà, il est difficile de contrôler les niveaux de protéine bactérienne produite lors de l&#39;introduction de l&#39;ADN étranger. Beaucoup de travail a établi électroporation d&#39;acides nucléiques dans les cellules bactériennes et de mammifères comme une technique de laboratoire commun; Cependant, il ya des recherches en cours sur les meilleures méthodes pour délivrer des protéines dans les cellules dans des conditions physiologiques. Rapports sur les protéines transfection sont prometteurs, mais nécessitent des réactifs coûteux et optimisation. Le désir d&#39;introduire effecteurs bactériens potentiellement toxiques dans une grande variété de cibles cellulaires avec un coût minimal nous a conduit à envisager l&#39;électroporation comme une méthode pour l&#39;étude de ces protéines in vivo. Protein électroporation 23-25 ​​est une rencontreHod d&#39;introduire des protéines dans des cellules vivantes par électroperméabilisation, aussi connu comme électro-transfection ou électro-injection 26. Cette technique utilise des impulsions à haute intensité de courant pour créer des pores dans les membranes cellulaires. Ces pores réversibles permettent macromolécules qui sont normalement exclues de l&#39;espace intracellulaire d&#39;entrer dans la cellule. Lors de l&#39;enlèvement du champ électrique externe, la membrane peut refermer, permettant à la cellule de retenir les molécules qui sont passés à travers les pores 27,28. Un électroporateur standard a été utilisé dans cette étude pour introduire systématiquement effecteurs bactériens dans les deux cellules de type macrophage souris et des cellules épithéliales humaines. La méthode est rapide, efficace et peu coûteux, sans diminution sensible de la viabilité cellulaire. Les protéines introduites peuvent être visualisées par microscopie d&#39;immunofluorescence ou utilisés pour des tests fonctionnels. Cela a été démontré en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que norme non toxique, ainsi quedeux protéines effectrices Salmonella, SspH1 et GtgE. Nous proposons protéines électroporation comme un outil supplémentaire dans le répertoire pour l&#39;étude des protéines de virulence bactérienne et leurs fonctions dans des cellules hôtes eucaryotes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Material or Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-050-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Methanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Culture Plastic</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>E. coli Pulser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent confocal microscope&#160;</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Model&#160; LSM 710&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Dishes for Microscopy</td>
			<td>Wilco Wells</td>
			<td>HBSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HALT Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">78430</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HeLa Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDS 4X Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Against Target of Interest</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Chill to 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Agarose Resin Suspension&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">646547</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8585</td>
			<td>Irritant, Toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of functional bacterial effectors into mammalian cells

L&#39;étude des interactions entre protéines dans le contexte de cellules vivantes peut générer des informations essentielles sur la localisation, la dynamique et partenaires d&#39;interaction. Cette information est particulièrement utile dans le contexte des interactions hôte-pathogène. De nombreuses protéines de pathogènes fonctionnent dans des cellules hôtes dans une variété de telle sorte que, ce qui permet l&#39;évasion du système immunitaire de l&#39;hôte et la survie dans l&#39;environnement intracellulaire. Pour étudier ces interactions hôte-pathogène cellulaires protéiques, plusieurs approches sont couramment utilisés, y compris: l&#39;infection in vivo avec une souche exprimant une protéine marquée ou mutant, ou l&#39;introduction de gènes de pathogènes par transfection ou transduction. Chacune de ces approches a ses avantages et ses inconvénients. Nous avons cherché un moyen d&#39;introduire directement des protéines exogènes dans les cellules. L&#39;électroporation est couramment utilisé pour introduire des acides nucléiques dans les cellules, mais a été plus rarement appliquée aux protéines bien que la base biophysique est exactement le même.Une électroporation standard a été utilisée pour introduire des effecteurs bactériens affinité marqué dans des cellules de mammifères. Cellules macrophages épithéliales humaines et de souris ont été cultivées par des méthodes traditionnelles, détachés, et placés dans 0,4 cm cuvettes d&#39;électroporation écart avec une protéine bactérienne pathogène exogène d&#39;intérêt (par exemple Salmonella Typhimurium GtgE). Après l&#39;électroporation (0,3 kV) et une courte période de récupération (4 h), la protéine intracellulaire a été vérifiée par marquage par fluorescence de la protéine par l&#39;intermédiaire de son marqueur d&#39;affinité et en examinant la distribution spatiale et temporelle par microscopie confocale. La protéine a également été montré une électroporation pour être fonctionnel dans la cellule et capable de trafic intracellulaire correct et l&#39;interaction protéine-protéine. Bien que les protéines exogènes ont tendance à se accumuler sur la surface des cellules, les échantillons ont électroporées fortes augmentations de la concentration intracellulaire effecteur par rapport à incubation seul. Le protocole est simple et assez rapide pour être fait dans apParallèle mode, permettant la caractérisation à haut débit de protéines pathogènes dans des cellules hôtes, y compris le ciblage et la fonction des protéines de virulence subcellulaire.

Comme une preuve initiale de concept, la protéine fluorescente verte purifié a été introduit avec succès dans des cellules de mammifères en utilisant l&#39;électroporation. GFP, environ un 27 kD d&#39;une protéine de poids moléculaire sont couramment introduits dans des cellules de mammifères (normalement exprimées à partir d&#39;ADN de plasmide) comme un outil de biologie moléculaire sans toxicité cellulaire significative. Des cellules HeLa ont été incubées (figure 1A) ou par électrop...

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Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Électroporation d&#39;effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K vues.  Pacific Northwest National Laboratory. Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells. 

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Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Recherche

Immunologie et infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l&#39;acide périodique Schiff coloration

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

La mise en œuvre d&#39;un système d&#39;infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Démêler la fonction d&#39;un effecteur bactérien à partir d&#39;un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l&#39;écran à deux hybrides

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Analyse d&#39;immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...