This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Comité de l&#39;Université de Californie, Davis, et adhéré à la Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health. 1. Préparation <ol><li> Préparer deux concentrés (25X) les stocks de solution modifiée de Tyrode à l&#39;avance et conserver à 4 ° C: (1) Stock I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) et (2) Stock II (en mM: NaHCO 3 500). <ol><li> Fraîchement préparer une solution de 2 L Tyrode de la composition suivante (en mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 et glucose 11,1 en combinant 1840 ml d&#39;eau désionisée (DI) l&#39;eau, 80 ml Stock I, 80 ml de stock II, et 4 g de glucose. Ne pas mélanger directement Stock I et II Stock; ajouter lem à 1.840 ml DI pour éviter la précipitation. </li></ol></li><li> Préparer la solution d&#39;achat d&#39;actions de l&#39;excitation-contraction découplant blebbistatin à 10 mg / ml dans anhydre di-méthylsulfoxyde (DMSO) à l&#39;avance et conserver la solution d&#39;achat d&#39;actions à 4 ° C. </li><li> Préparer des solutions mères de colorants fluorescents: (1) RH237 tension sensible colorant (1 mg / ml dans le DMSO) et (2) Indicateur de faible affinité calcium Fluo-5N AM (2 mg / ml dans le DMSO) selon les recommandations du fabricant. Utilisez les préparatifs immédiatement pour éviter la décomposition avec perte subséquente de la capacité de chargement. </li><li> Le premier système de recirculation de la perfusion de Langendorff avec oxygénée (95% de O 2, CO 2 5%) solution de Tyrode. Régler le débit de O 2 / CO 2 pour maintenir le pH de la solution de Tyrode à 7,4 ± 0,05. Utilisez un filtre net en ligne en nylon tissé (taille des pores: 11 pm) pour filtrer en continu la solution de perfusion. <ol><li> Premier système de perfusion à température ambiante, comme loadi ultérieureng de Fluo-5N AM est effectuée à température ambiante. Pour Fluo-5N AM chargement, utiliser un petit volume de recirculation de perfusion (~ 150 ml). Après charge de colorant, utiliser un plus grand volume de liquide de perfusion (1 - 2 L, voir figure 1C). </li></ol></li><li> Tournez sur le système d&#39;acquisition de données et de préparer pour la surveillance en continu de l&#39;ECG et de la perfusion pression. Préparer le système de surveillance de pression: Brancher un capteur de pression à la ligne de perfusion et de surveiller la pression de perfusion avec un amplificateur de Transbridge. Ajuster la pression de perfusion de base à 0 mm de Hg lorsque le coeur ne soit pas connectée au système de perfusion. </li><li> Alignez les caméras de cartographie optique pour assurer un alignement spatiale entre le m V et SR Ca 2+ signaux. <ol><li> Tout d&#39;abord, concentrer les caméras en plaçant une règle ou un objet avec le texte dans le plat de perfusion. Tournez les caméras de cartographie dans un mode de vue en direct et la mise au point jusqu&#39;à ce que le texte est clair et net. Acquérir une image de trame unique de chaque caméra. </li><li> Overlayces images et d&#39;ajuster la transparence de l&#39;image du haut de sorte que les deux images sont visibles. Le texte dans les images doivent se chevaucher exactement. Si pas parfaitement alignés, de régler l&#39;angle du miroir dichroïque ou la position de chaque caméra jusqu&#39;à ce que les deux images sont alignées. </li></ol></li></ol> 2. récolte, de perfusion, et Dye-chargement du Lapin Coeur <ol><li> Fixez le lapin dans un dispositif de retenue de lapin approuvé. Profondément anesthésier via une injection intraveineuse (veine marginale de l&#39;oreille) de pentobarbital sodique (50 mg / kg) et de l&#39;héparine (1000 IU). <ol><li> Lorsque le lapin affiche absence de réflexes nociceptifs, faire une incision cutanée médiane pour exposer le sternum et les côtes. Couper à travers le sternum avec des ciseaux chirurgicaux contondants pointe de la xyphoïde au manubrium. Prenez soin de ne pas endommager le coeur lors de l&#39;ouverture du sternum. Étaler les côtes pour exposer le coeur. </li><li> Exciser rapidement l&#39;ensemble du bloc cœur-poumon en coupant rapidement tous les navires et les tissus conjonctifs. Immediadiatement placer le bloc cœur-poumon dans la solution glacée Tyrode. </li></ol></li><li> Situer l&#39;aorte pour perfusion rétrograde. Couper l&#39;aorte ascendante juste en amont de trois branches de la crosse aortique. Cathétériser l&#39;aorte à une canule de 8 G connecté au système de perfusion. Utilisez un morceau de suture USP 0 de soie pour sécuriser l&#39;aorte sur la canule. </li><li> Disséquer soigneusement la trachée, poumons, et la graisse épicardique du coeur. Avec une pince et des ciseaux pointus de dissection, localisez la valve mitrale et soigneusement d&#39;endommager ou de retirer un dépliant pour prévenir la congestion de la solution dans le ventricule gauche. </li><li> Immerger le coeur dans la chambre de perfusion verre chemisé horizontalement avec la surface antérieure du cœur vers le haut pour l&#39;imagerie. Fixer la canule à un morceau de Sylgard avec les repères en forme de U sur le fond de la coupelle de silicium pour empêcher le mouvement du cœur au cours de la cartographie (figure 1D). Si désiré, ajouter une petite épingle d&#39;insectes à la pointe du cœur pour stabilisation. </li><li> Position électrocardiogramme (ECG) électrodes dans le bain sur le côté droit et gauche du cœur. Immerger entièrement les électrodes dans le bain et veiller à ce qu&#39;ils ne sont pas en contact avec la surface du cœur de fournir un ECG de volume menée analogue à une configuration plomb I. Vérifier un plomb je ECG morphologie normale. Ajuster le flux (25 - 35 ml / min) pour s&#39;assurer que la pression aortique est maintenue à 60 - 70 mm de Hg. </li><li> Éteignez les lumières de la pièce et d&#39;ajouter de 0,3 à 0,6 ml de solution stock blebbistatin (étape 1.2) au perfusat (concentration finale 10 - 20 uM). <ol><li> Éteignez les lumières des chambres pour éviter photoinactivation de blebbistatin. Si nécessaire, un petit coup de projecteur ou projecteur peuvent être utilisés pour fournir un éclairage de la tâche. Remarque: blebbistatin est un inhibiteur d&#39;ATPase de la myosine et un découpleur excitation-contraction. Parce Fluo-5N chargement nécessite des conditions prolongées (60 min) RT (hypothermie) (voir les étapes 2.8 - 2.10), la production d&#39;énergie cardiaque pourrait être compromise. Therefore, plus de blebbistatin dans le perfusat avant charge de colorant peut réduire la demande d&#39;énergie 16 et d&#39;éliminer les artefacts de mouvement pendant les enregistrements optiques ultérieurs 17. </li></ol></li><li> Lorsque la contraction du cœur a cessé (10 - 15 min, vérifié sur l&#39;enregistrement de la pression aortique), basculer vers le système de recirculation perfusion de petit volume (voir l&#39;étape 1.4.1). </li><li> Préparer et charger solution de chargement Fluo-5N AM: Ajouter 0,25 ml de Fluo-5N AM solution stock (étape 1.3) à 0,25 ml chaude 20% de Pluronic F127. Ajouter 0,5 ml de solution de Tyrode chaud au mélange, bien mélanger et ajouter au système de recirculation perfusion de petit volume. </li><li> Surveiller en permanence la pression de perfusion et de l&#39;ECG et de régler le débit si nécessaire. Dye chargement dure environ 1 heure à température ambiante. 45 min après le chargement a commencé, tourner sur le bain d&#39;eau circulant pour commencer le réchauffement du système de perfusion et de perfusion à 37 ° C. </li><li> Après 60 min de Fluo-5N AM chargement, switch la perfusion à l&#39;ensemble du système de recirculation de perfusion de volume (voir l&#39;étape 1.4). </li><li> Diluer 50 pi de tension sensible solution colorant RH237 de stock (étape 1.3) dans 1 ml de la solution de Tyrode tiède et ajoutez lentement (~ 5 minutes) dans une proximale de l&#39;orifice d&#39;injection de la canule. </li></ol> 3. cartographie optique <ol><li> Pendant les derniers moments de charge de colorant, positionner le coeur et concentrer les caméras de cartographie optique pour assurer le champ approprié de vue de l&#39;expérience. </li><li> Si désiré, placer une électrode de stimulation bipolaire sur la surface épicardique du cœur pour la stimulation. </li><li> Placez un plastique ou en verre lamelle sur la surface de la chambre de perfusion pour réduire l&#39;artefact de mouvement sur la surface du liquide qui peut être présent en raison de la recirculation du liquide de perfusion. Remarque: Comme alternative à une lamelle, utilisez un couvercle de Petri plat propre plastique de 50 mm. </li><li> Concentrer les guides de lumière pour éclairer uniformément la surface du cœur avec eXCitation lumière. Utilisez diode électroluminescente bleue (LED) sources de lumière et de filtrer davantage la lumière avec un 475-495 nm filtre passe-bande (figure 1A). </li><li> Recueillir fluorescence émise avec un macroscope et deux complémentaires métal-oxyde-semiconducteur (CMOS) caméras de cartographie optique. Diviser la lumière émise avec un miroir dichroïque à 545 nm. <ol><li> Filtre passe-long de la longueur d&#39;onde fragment, contenant le signal de V m, à 700 nm. -Filtre passe-bande de longueur d&#39;onde la plus courte fragment, contenant le SR signal de Ca 2+, 502 à 534 nm (figure 1A). Régler la fréquence d&#39;acquisition de données optiques de 0,5 à 1 kHz. </li></ol></li><li> Pour chaque enregistrement optique, d&#39;abord lancer le protocole de stimulation souhaité, allumez la lumière d&#39;excitation, et de recueillir: 1 - 4 sec des données. Si désiré, synchroniser l&#39;acquisition des protocoles et des données stimulation. Remarque: Il est impossible de re-charger le Fluo-5N AM, donc le rapport signal sur bruit (SNR) sera decreasoi tout au long de l&#39;expérience en raison de teindre les fuites de la SR. Limitez protocole expérimental à 1 - 2 h pour assurer des valeurs élevées de SNR. </li><li> À la suite de l&#39;expérience, laver le système de perfusion dans la séquence de l&#39;eau DI, 70% d&#39;alcool réactif, et de nouveau avec de l&#39;eau DI. </li><li> Filtre à chaque jeu de données avec un filtre gaussien spatial (rayon de 3 pixels) en utilisant des progiciels disponibles dans le commerce selon le protocole du fabricant. </li><li> Si nécessaire, aligner spatialement la m V et SR Ca 2+ ensembles de données. Comme à l&#39;étape 1.6, superposer des images de chaque caméra et vérifier que les structures anatomiques du coeur (ie., Vasculaire coronaire, les bords des oreillettes ou les ventricules) ou d&#39;autres objets dans le champ de vision (par exemple, la canule, l&#39;électrode de stimulation) exactement chevauchement. Si non, alignement spatial des ensembles de données est nécessaire. </li><li> Décaler l&#39;image supérieure transparente dans le x et y direction jusqu&#39;à ce que le chevauchement exacte est atteinte, en prenant note du nombre de pixelsl&#39;image doit être décalée dans chaque direction. L&#39;ensemble des données correspondant à l&#39;image du haut (soit V m ou SR Ca 2+) doit alors être déplacé par le nombre déterminé de pixels dans chaque direction pour assurer un alignement précis entre le m V et SR Ca 2+ ensembles de données. </li></ol>

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	<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li><li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai(2+)+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology.">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , (2001).</li><li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes.">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle.">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions.">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li><li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans.">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li><li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++scraps:+local+depletions+of+free+[Ca2+]+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2++reserve.">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li><li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations.">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li><li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+determines+Ca2++alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology.">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++in+the+intact+heart:+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation.">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li><li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+Changes+During+Hypoxia,+Ischemia,+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations.">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li><li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li><li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia.">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li><li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure:+mechanisms+and+therapeutics.">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li><li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les clés du succès Fluo-5N charge de colorant sont la configuration recirculation perfusion de petit volume, ce qui permet une concentration élevée Fluo-5N sans avoir besoin de grandes quantités de colorant, la longueur des temps de chargement (1 h), et effectuer le chargement à la température ambiante. Si le chargement est effectué à des températures physiologiques, l&#39;activité enzymatique cellulaire rapidement clive le tag de -AM lorsque le colorant traverse la membrane cellulaire, le piégeage des molé...

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S271-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">CaCl2 (2H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">C79-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S217-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MgCl2 (6H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">M33-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaH2PO4 (H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S369-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S233-3</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">D16-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">95% O2 5% CO2</td>
			<td style="width:167px;">AirGas</td>
			<td style="width:151px;">carbogen</td>
			<td style="width:423px;">For oxygenation and pH of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:167px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:151px;">1760</td>
			<td style="width:423px;">Excitation-contraction uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">RH237</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">61018</td>
			<td style="width:423px;">Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Fluo-5N AM</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">F-26915</td>
			<td style="width:423px;">Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pluronic F127</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">59004</td>
			<td style="width:423px;">For Ca2+ indicator loading; Warm until the solutiion is clear before use</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td style="width:423px;">For dissolving blebbistatin and dyes</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Filter</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:151px;">NY1104700</td>
			<td style="width:423px;">11um in-line filter</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">BLPR2</td>
			<td style="width:423px;">For measuring perfusion pressure</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:423px;">For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:167px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">For continuous recording of pressure and ECG signals</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">THT Macroscope</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Macroscopic optical setup. Details: 0.63x objective (NA=0.31), 2x condensing objective, resultant field of view = 3.1x3.1 cm, depth of focus = ~1.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MiCam Ultima-L CMOS</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Optical mapping cameras</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Precision LED Spot Light</td>
			<td style="width:167px;">Mightex</td>
			<td style="width:151px;">PLS-0470-030-15-S</td>
			<td style="width:423px;">LED light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

La figure 1A représente un diagramme schématique de la configuration optique pour double m V SR Ca2 + et la cartographie. Avec cette configuration, il ya une séparation spectrale complète de la m V et SR Ca 2+ signaux (figure 1B). Un schéma du système de perfusion à double boucle utilisée pour Fluo-5N colorant chargement est illustrée à la figure 1C. La figure 1D montre l&#39;orientation horizontale ...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Cet article décrit le protocole détaillé et l&#39;équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d&#39;une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l&#39;observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.1K vues.  University of California Davis.  Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact. 