KO et AC sont soutenus par une subvention et une bourse de l&#39;American Heart Association. SIB et RB sont soutenus par des subventions du NIH.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Cliquez ici pour voir un aperçu de l&#39;analyse semi cardiaque automatisé (SOHA) procédure.</a> Semi-automatique d&#39;analyse battement optique 1. Prétraiter - Cette étape donne des informations sur les diamètres cardiaque diastolique et systolique. Bords de coeur sont identifiées et marquées pendant la diastole et systole maximale. Enregistrements optiques peuvent être avancées à des vitesses lentes et même une image à un moment permettant l&#39;identification précise des images où la contraction et la relaxation maximale du cœur se produisent. Une paire de marques d&#39;identification des bords diastolique et une paire d&#39;identifier les bords systolique sont faites. Les marques peuvent aussi être faites en double exemplaire à différents endroits le long du coeur horizontale. Les diamètres du cœur obtenue dans cette étape sont également utilisés pour calculer une mesure supplémentaire qui fournit une estimation de la contractilité du cœur. Cette mesure est le raccourcissement fractionnel pour cent (% FS) et elle représente la mesure dans laquelle les bords du cœur vers l&#39;autre lors d&#39;une contraction. La formule utilisée pour calculer% FS est la suivante: (((Diamètre diastolique - diamètre systolique) / diamètre diastolique) x 100) Remarque - Les points identifiés dans cette série sont utilisés uniquement pour les mesures de diamètre et la fraction de raccourcissement et ne sont pas utilisés pour la détection de mouvement. Exemple: (. Cammarato, et al 2008) Chez la drosophile, des mutations ponctuelles dans le domaine du transducteur chaînes lourdes de myosine, une région connue pour moduler l&#39;activité enzymatique du moteur, résultat dans les coeurs qui sont dilatés ou restreinte selon qu&#39;ils suppriment ou améliorer l&#39;activité myosine de l&#39;ATPase . Ces types de mesures ne peut être faite dans les mouches intact comme il n&#39;est généralement pas possible d&#39;identifier les bords du cœur sur toute la longueur du tube de cœur à travers la cuticule et la graisse, (comparez type sauvage, D45 et Mhc5 M-modes dans &quot;M-mode Figure &quot;ci-dessous) qui, normalement, entourent le cœur. Les mesures faites au moment de visualiser le cœur de mouches intacte avec d&#39;autres méthodes couramment employées sont généralement limités à la partie la plus antérieure du cœur, la région de chambre conique. Il n&#39;est également pas possible d&#39;obtenir cette mesure dynamique dans des tissus fixés. 2. Détection de Mouvement Cette étape se fait automatiquement par le programme et utilise deux algorithmes différents pour analyser les mouvements de chaque film. Brièvement, le premier algorithme, le &quot;Darkness Moyenne Frame&quot; algorithme utilise un châssis par l&#39;approche du cadre. Cela représente en moyenne algorithme de l&#39;intensité obscurité pour une trame film entier, normalise la valeur d&#39;un intervalle entre 0 et 1, et les parcelles de la moyenne normalisée pour chaque trame dans le film au cours du temps. La deuxième approche, le &quot;pixel par pixel&quot; algorithme, analyse les changements dans les ténèbres de l&#39;ensemble des pixels individuels d&#39;une image à la suivante. Pixels qui présentent des changements d&#39;intensité au-dessus d&#39;un seuil prédéfini sont additionnées pour chaque trame et tracées pour chaque trame dans le film au cours du temps. 3. Vérifiez Intervalles- La sortie des deux algorithmes de détection de mouvement est affiché dans ce module avec le &quot;Darkness moyenne&quot; de sortie s&#39;affiche dans une fenêtre au-dessus du &quot;pixel par pixel&quot; fenêtre de sortie. Afin d&#39;être sûr que les intervalles de détection d&#39;accord avec le mouvement dans le film nous affichons une réelle bord trace ou en mode M faite à partir des images en cours d&#39;analyse directement sous les fenêtres de sortie algorithme. Le mode M est fait par tranches de coupe numériquement un pixel de largeur à travers le cœur de chaque trame dans le film et de les aligner horizontalement pour fournir un instantané des mouvements pointe du cœur au cours du temps. Dans le &quot;pixel par pixel&quot; fenêtre de l&#39;intervalle identifié diastolique sont indiqués par une ligne horizontale verte avec le nombre d&#39;images qui contribuent à cet intervalle directement au-dessus. Intervalles systoliques sont identifiés comme étant l&#39;intervalle entre deux diastoles successives. Le début d&#39;une systole est indiqué dans le mode M par une ligne verticale bleue et la fin est indiquée par une ligne verticale rouge. Avec cet affichage, il est relativement facile de voir si la sortie de l&#39;algorithme est d&#39;accord avec les mouvements du cœur réel. Bien que la détection de mouvement est effectuée automatiquement la sortie doit être vérifié l&#39;exactitude. Il ya plusieurs raisons à cela: l&#39;une est qu&#39;il ya souvent un sous-jacent, la fluctuation des niveaux d&#39;ondes lentes de lumière n&#39;est pas liée au mouvement du cœur. Ceci peut habituellement être éliminés par l&#39;utilisation d&#39;un construit en filtre passe-haut. Une deuxième raison a trait à la sensibilité du &quot;pixel par pixel&quot;. La sortie de cet algorithme est généralement de deux traces du mouvement, un pour le mouvement de contraction et un pour le mouvement de détente. En plus les mouches et dans certains mutants de la longueur de temps entre ces deux mouvements<html> devient relativement longue et le programme tente d&#39;interpréter les deux mouvements que deux battements séparés. Ceci peut être corrigé en demandant au programme de comparer la sortie du pixel par pixel avec algorithme de celle de l&#39;algorithme de Ténèbres de trame moyenne, en cliquant sur les &quot;ténèbres Utilisez« boîte. Exemple (voir vidéo): Dans 5 à 7 semaines mouches les intervalles systolique sont généralement beaucoup plus longue que chez les mouches jeunes. Ces longs intervalles sont d&#39;abord détectés comme deux contractions séparés par un diastole courte. Ceci peut être corrigé en sélectionnant les «ténèbres Utilisez&quot; case à cocher. Dans ce cas, le programme permettra de comparer l&#39;intervalle diastolique identifiés par le pixel par pixel avec l&#39;algorithme de la sortie Ténèbres trame moyenne. Si la sortie de trame moyenne Ténèbres a une valeur positive, alors tout intervalle diastolique identifiés dans le pixel par pixel l&#39;algorithme sera ignoré et les intervalles seront correctement spécifiés. Le film entier peuvent être numérisés en 10 segments deuxième et accepté (cliquez sur &quot;OK ​​Données&quot;) ou rejetée (cliquez sur &quot;Jeter des données»). Le Salut et les sensibilités passent Lo filtre peut être ajustée manuellement pour aider à définir plus précisément les intervalles de contraction lors de l&#39;utilisation de l&#39;algorithme Ténèbres. 4. Statistiques-sorties Une fois la sortie pour un film donné a été accepté, le programme va utiliser ces informations pour calculer automatiquement un certain nombre de paramètres. Il s&#39;agit notamment de l&#39;intervalle systolique et diastolique, la période cardiaque et du rythme cardiaque, la direction et la vélocité de l&#39;onde de contraction FS, diamètres du cœur, et%. En outre, le programme a de multiples méthodes pour quantifier arrhythmicity reflétant non uniforme contraction et la relaxation des cycles (voir Fink et al, 2009). Sortie de la statistique est fournie pour chaque film individuellement et pour l&#39;ensemble des données sous la forme d&#39;une valeur séparées par une virgule (. Csv) qui peut être ouvert dans un tableur comme Microsoft Excel. Tableau 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> Un exemple de la sortie générée par le semi-automatique du programme Cœur analyse optique. 5. Mise à jour Histogrammes- Cette partie du programme affiche toutes les données sur les intervalles de coeur pour un jeu de données dans le format histogramme. Depuis les fréquences cardiaques sont variables, nous normaliser les données de sortie histogramme. Cependant, parce que la distribution des intervalles n&#39;est pas symétrique autour d&#39;une moyenne, nous utilisons la valeur médiane de l&#39;intervalle de notre normalisation. Exemple (voir vidéo): Les mouches qui sont mutantes pour le canal potassique KCNQ montrent extrêmement irrégulières intervalles systolique et diastolique. Généralement, les intervalles systolique sont beaucoup plus longs et plus irrégulières que dans appariés selon l&#39;âge des mouches de type sauvage. Cela peut être clairement perçue par l&#39;affichage des données en format histogramme (voir aussi Ocorr et al. 2007). 6. Le mode M- Ce module génère M-modes qui peuvent être fabriqués à partir de n&#39;importe quelle position le long du cœur dans le cadre du film. La longueur de la M-mode peut aussi être spécifiée. M-modes sont utiles pour montrer qualitativement ce que le cœur est fait dans un film. Exemple (voir vidéo): Film d&#39;un cœur de poisson zèbre vieilles trois jours les larves montrant le ventricule antérieur qui est utilisée pour générer un M-mode. La tranche verticale de pixels qui seront excisés électronique de chaque cadre du film est indiquée par une ligne rouge. Le mode M Figure: Exemples de M-modes de la drosophile et le poisson zèbre. Une des mutations myosine discuté dans les résultats Prétraiter étape dans un moteur moléculaire avec la cinétique enzymatique rapide entraînant une restriction coeur et parfois un bloc de conduction. Les deux paramètres peuvent être montré qualitativement à l&#39;aide de M-modes. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-modes Exemples" /> M-modes fait dans la même partie du cœur dans les deux de type sauvage et mouches mutantes montrent clairement le phénotype restreint dans le CMH 5 mutants et les diamètres dilatés et cycles de contraction arythmique du mutant D45 (qui exprime la myosine avec la cinétique enzymatique déprimés) (modifié à partir Cammarato et al., 2008). M-mode fabriqués à partir d&#39;un cœur Zebrafish larves montrant le ventricule antérieur (film même cœur, comme indiqué dans la démonstration, Fink et al 2009). 7. Red Dot Movie- Ce module génère automatiquement un ralenti (1:4), 20 seconde version d&#39;un film montrant analysé tous les pixels qui sont identifiés comme changer en rouge. Cette fonctionnalité est principalement utilisée à des fins d&#39;illustration. Film 1 - Un &quot;film red dot» montrant les pixels qui sont identifiés comme ayant les changements d&#39;intensité obscurité par les algorithmes du programme en rouge. La vitesse de film est ralenti par rapport à l&#39;original par un facteur 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Cliquez ici pour télécharger la vidéo 1. 8. Les demandes additionnelles- Nous avons commencé à appliquer ce système d&#39;analyse pour les films à haute vitesse des autres modèles avec des petits coeurs qui sont souvent difficiles à analyser en utilisant la méthodologie traditionnelle. Nous avons appliqué avec succès cette analyse à la fois le poisson-zèbre cœur des larves et des cœurs embryonnaires de souris (Fink et al, 2009). Film 2 - film coeur de la souris ainsi que la figure avec des intervalles vérifier avec la sortie des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Cliquez ici pour télécharger Movie 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Vérifiez Intervalles cœur de la souris" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le modèle de drosophile s&#39;est avérée être un puissant outil génétique qui a été utilisée pour traiter une variété de questions scientifiques allant du développement embryologique de l&#39;apprentissage et la mémoire. Récemment cet organisme modèle polyvalent a été utilisé pour étudier la génétique de la fonction cardiaque. Un certain nombre de tentatives pour quantifier la physiologie cardiaque chez les adultes de drosophile sont appuyés sur les observations faites chez des mouches intacte à t...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Nous avons développé une méthode d&#39;analyse des enregistrements optiques très haut débit à partir<em&gt; Drosophile</em&gt;, Le poisson-zèbre et les cœurs embryonnaires de souris (Fink, et. Al., 2009). Notre semi-automatique d&#39;analyse Heartbeat optique (SOHA) utilise un algorithme de détection de mouvement de roman qui est capable de détecter les mouvements cardiaques associés à contractiles individuels et les événements de relaxation. Le programme offre une multitude de lectures physiologiquement pertinents, y compris la tension systolique et diastolique des intervalles, du rythme cardiaque, ainsi que des mesures qualitatives et quantitatives des arrhythmicity battement de coeur. Le programme calcule également les mesures de diamètre cardiaque pendant deux diastole et la systole à partir de laquelle la fraction de raccourcissement et les changements aire fractionnaire sont calculés. La sortie est fourni sous forme de fichier numérique compatible avec la plupart des tableurs. Les mesures sont réalisées pour chaque battement de cœur dans un dossier augmente la puissance statistique de la sortie. Nous démontrons chacune des étapes où entrée utilisateur n&#39;est requise et montrer l&#39;application de notre méthodologie à l&#39;analyse de la fonction cardiaque dans les trois modèles génétiquement coeur docile.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts at JoVE.com

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Nous avons développé une méthode semi-automatisée d&#39;analyse optique Heartbeat (SOHA) pour l&#39;analyse des enregistrements optiques très haut débit à partir<em&gt; Drosophile</em&gt;, Le poisson-zèbre et les cœurs embryonnaires de souris. Nous démontrons l&#39;application de notre méthodologie à l&#39;analyse de la fonction cardiaque chez la mouche des fruits et des cœurs embryonnaires de souris.

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vues.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Nous avons développé une méthode semi-automatisée d'analyse optique Heartbeat (SOHA) pour l'analyse des enregistrements optiques très haut débit à partir Drosophile, Le poisson-zèbre et les cœurs embryonnaires de souris. Nous démontrons l'application de notre méthodologie à l'analyse de la fonction cardiaque chez la mouche des fruits et des cœurs embryonnaires de souris.

Vidéo: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Entretien et nettoyage du microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Recherche

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Principales composantes d&#39;un microscope optique

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Un Plugin ImageJ pour semi-automatique de mesure Forme Feuille

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Analyse quantitative des propriétés viscoélastiques des globules rouges à l’aide de pinces optiques et de microscopie à défocalisation

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Isolement semi-automatisé de tissu adipeux blanc murin

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Pleins feux sur l’auteur : Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...