Le soutien de l&#39;Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l&#39;Australie (566 559). Ce travail est financé par le CRC d&#39;Imagerie Biomédicale Development Ltd, établie et soutenue dans les centres du gouvernement australien s de Recherche Coopérative (CRC). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d&#39;imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail.

Préparation de cellules <ol><li> Homme érythroleucémique K562 cellules sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% (v / v) de sérum bovin foetal et 20 mg / ml de gentamicine dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l&#39;environnement à 37 ° C. </li><li> Environ 18 heures avant la coloration des cellules en croissance exponentielle laver (optimale à 5 x 10 5 cellules / ml) avec un tampon phosphate salin (PBS), remettre en suspension dans un milieu frais et retour à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation à environ 1500 rpm pendant 5 minutes et remettre en suspension dans un milieu frais. </li><li> Compter les cellules et d&#39;ajuster la densité cellulaire d&#39;environ 5 x 10 5 cellules / ml. </li></ol> Les cellules peuvent être comptés, soit par une méthode automatisée (par exemple, ou de Sysmex Coulter avec la taille de filtre entre 5 à 20 microns) ou en utilisant la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan et un hémocytomètre. Nombre excessif de cellules (&gt; 800 cellules / cm 2) peut conduire à la non-uniforme coloration. Irradiation et immunofluorescence <ol><li> Assemblez des clips cytospin, cartes de filtre et de diapositives avec un étiquetage approprié. </li></ol> Lors du montage de l&#39;appareil cytospin s&#39;assurer que le trou dans la carte du filtre coïncide avec l&#39;entonnoir. <ol start="2"><li> Exposer les cellules soit γ-irradiation ou les rayons X (2GY dans cet exemple). </li></ol> Pour prévenir la formation de foyers pendant l&#39;irradiation, maintenir les cellules sur la glace pendant 5 à 10 minutes avant et pendant l&#39;irradiation. Après l&#39;irradiation incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant le temps nécessaire (pour des niveaux de pointe de 30 γH2AX minutes à 1 heure, 1 heure dans cet exemple). <ol start="3"><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS froid par centrifugation et remettre en suspension dans du PBS frais. </li><li> Distribuer 100 à 150 pi de la suspension cellulaire dans chaque entonnoir cytospin et de spin à 500 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Séparez les diapositives de cytospins et permettre aux cellules de modérément air sec pendant environ 15 minutes. </li></ol> Ne laissez pas sécher complètement les cellules de morphologie cellulaire peut se désintégrer. <ol start="6"><li> Tracez un cercle autour des cellules avec un stylo hydrophobe. </li><li> Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% pendant 5 minutes à température ambiante (TA). </li></ol> Dans notre expérience, la fixation au paraformaldéhyde est supérieure à la fixation avec de l&#39;éthanol ou de méthanol. Les cellules en suspension nécessitent une fixation pendant 5 minutes à température ambiante alors que les temps de fixation plus long (15 à 20 minutes) sont nécessaires pour une fixation optimale des cellules adhérentes. Nous trouvons que la coloration des rendements immédiatement de meilleurs résultats que le stockage des lames fixées à -20 ° C, ce qui aboutit généralement à la fluorescence de fond élevé. <ol start="8"><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton-X 100 à TA pendant 5 minutes. </li></ol> Comparé à Tween-80, nous observons généralement de meilleurs signaux dans les cellules perméabilisées avec du Triton X-100. Selon le type de cellule, il peut être nécessaire de changer l&#39;heure de perméabilisation. Par exemple, dans les cellules K562 perméabilisation pendant 5 minutes à température ambiante est suffisante alors que dans des cellules adhérentes une perméabilisation 15 minutes est nécessaire. <ol start="10"><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. </li><li> Bloc cellules dans 1% de BSA pendant 30 minutes (3 x 10 minutes) à température ambiante. </li></ol> Nous avons comparé l&#39;efficacité bloquant en utilisant le sérum (provenant de la même espèce que l&#39;anticorps secondaire) et l&#39;albumine sérique bovine dans du PBS. BSA a été plus efficace pour réduire au minimum la liaison non spécifique de l&#39;anticorps secondaire par rapport au sérum. Nous avons comparé les différents temps de blocage, le blocage nuit à 4 ° C par rapport à 3 x 10 minutes et 3 x 20 minutes étapes bloquant à la température ambiante, et a déterminé que le blocage de 3 x 10 minutes a été optimale. <ol start="12"><li> Ajouter 50 ul d&#39;anticorps primaire (1: 500 dilué dans 1% de BSA) à chaque diapositive. </li></ol> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire à température ambiante pendant 60 minutes dans les résultats de la coloration de fond réduite par rapport à une nuit d&#39;incubation à 4 ° C. <ol start="13"><li> Pour tache différents marqueurs simultanément utiliser des anticorps dirigés dans différentes espèces (souris par exemple les anti-γH2AX et de lapin anti-méthylé H3K4 dans cet exemple). </li><li> Incuber avec des anticorps primaires pendant 90 minutes à température ambiante sur une plateforme à bascule à 250 rpm. </li></ol> Toutes les incubations sont effectuées dans une auge coloration humidifié. <ol start="15"><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. </li><li> Ajouter 50 uL d&#39;(1: 1000 dilué dans 1% de BSA) anticorps secondaire à chaque diapositive. </li></ol> Pour les taches pour différents marqueurs sur la même lame utiliser des anticorps secondaires avec dspécificité d&#39;espèce DIFFÉRENTES (selon l&#39;anticorps primaire) et la fluorescence d&#39;onde d&#39;émission (par exemple anti-souris Alexa 488 (vert) et anti-lapin Alexa-546 (rouge) dans cet exemple). <ol start="17"><li> Incuber les cellules pendant 60 minutes à température ambiante sur une plateforme à bascule à 250 rpm. </li></ol> Il est recommandé d&#39;incuber les cellules dans une chambre noire humide pour éviter la décoloration et le séchage de l&#39;anticorps secondaire. <ol start="18"><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. </li><li> Ajouter 50 uL d&#39;(1:500 dilué dans du PBS) TOPRO-3 à chaque diapositive. </li><li> Laver les lames avec du PBS pendant 5 minutes 3X. </li><li> Retirer l&#39;excès d&#39;humidité à partir de diapositives et ajouter anti-fade solution. </li></ol> Il est recommandé de ne pas sécher complètement avant d&#39;ajouter les cellules anti-fade solution. <ol start="22"><li> Lamelle, sceller avec du vernis à ongles et laissez glisse la nuit dans l&#39;obscurité à température ambiante. </li></ol> Il est recommandé d&#39;utiliser des lamelles spécifiques confocale # 1.5 (de 0,16 à 19 microns d&#39;épaisseur) et vernis à ongles transparent. En plaçant la lamelle sur la lame, les soins devraient être prises pour éviter la formation de bulles d&#39;air. L&#39;acquisition des images <ol><li> Un microscope confocal Zeiss LSM510 Meta est utilisé pour acquérir des images en utilisant le standard GFP (green, 488 nm), PI (rouge 543 nm) et les lasers rouge lointain (bleu 633 nm). </li></ol> Les images acquises en utilisant un microscope confocal révèle une meilleure résolution spatiale. Comme la taille des foyers γH2AX peut être inférieure à 0,5 μicrons, il est recommandé d&#39;acquérir des images avec au moins une taille de 0,5 μicron étape le long de l&#39;axe Z.. A 63 l&#39;huile d&#39;immersion x objectif est préférée par rapport à un grossissement soit supérieur ou inférieur. Pour les cellules d&#39;imagerie pour de nombreux foyers comptant, il est préférable d&#39;utiliser une vitesse de balayage de 8 et taille d&#39;image de 1024 x 1024 pixels. Pour illustrer la relation spatiale entre différentes protéines nucléaires, il est recommandé d&#39;utiliser une vitesse de balayage de 6 avec taille d&#39;image de 2048 x 2048 pixels. Lorsque l&#39;imagerie par de multiples canaux d&#39;une acquisition scanner en ligne est recommandé par rapport à un balayage de trame. Cela évite de blanchiment et de meilleure résolution est obtenue. Balayage séquentiel est utilisé pour prévenir saigner à travers entre les canaux. Le comptage des foyers L&#39;analyse d&#39;image et de compter les foyers peuvent être effectuées en utilisant divers logiciels (inlcuding Metamorph, Image-J et Imaris). La procédure pour le comptage des foyers utilisant Metamorph est décrite ici. <ol><li> Ouvrez piles d&#39;images γH2AX soit directement à partir du menu fichier ou en utilisant le numéro de build piles option. </li><li> Aller dans le processus de menu et choisit l&#39;arithmétique de la pile. </li><li> Choisissez la projection maximale et sélectionnez les avions à inclure et cliquez sur OK. </li><li> Enregistrer l&#39;image résultante comme un Tiff γH2AX. fichier et ouvrez le TOPRO-3 (bleu) de l&#39;image. </li><li> Aller vers les régions et de sélectionner un outil de dessin région et d&#39;élaborer les régions autour de noyaux. </li><li> Cliquez sur l&#39;image Tiff γH2AX et aller au menu de processus et de sélectionner des filtres morphologiques. </li><li> Chose Top-Hat et sélectionnez l&#39;image que γH2AX une image source. </li><li> Appliquer Top-Hat filtre et l&#39;image résultante sera une image binaire avec moins de bruit et de la variation d&#39;intensité réduite dans les foyers. </li></ol> Des précautions doivent être prises au moment de choisir Top-Hat valeurs. Les valeurs optimales peuvent être obtenues par comparaison visuelle des images avant et après l&#39;application de filtres. <ol start="9"><li> Allez dans le menu et sélectionner l&#39;image processus de seuil. </li><li> Choisissez le seuil inclusif et sélectionner les valeurs de seuil inférieur et supérieur. </li></ol> Il est généralement les valeurs de seuil qui affectent plusieurs foyers. Par conséquent, une grande attention est requise lors de la sélection des valeurs de seuil. Ce peut être mieux assuré par le nombre des foyers comptant en utilisant différents seuils dans les cellules exposées à la baisse de 2 Gy de rayonnement γ-, puis de comparer le nombre des foyers avec comptage manuel (par œil). La valeur du seuil optimal est celui qui minimise l&#39;inclusion de fond et maximiser l&#39;intégration des foyers. <ol start="11"><li> Sélectionnez l&#39;image TOPRO-3 et allez dans le menu des régions et sélectionnez l&#39;option de transfert de régions. Sélectionnez l&#39;image source que TOPRPO-3 et la destination comme Top-Hat et cliquez sur OK. </li><li> Une fois les régions nucléaires sont transférées à l&#39;image chapeau allez dans le menu de mesurer et sélectionnez Analyse morphométrie intégré. </li><li> Dans la fenêtre pop-up de sélection de source d&#39;image-Top-Hat et de mesurer par zone. </li><li> Sélectionnez la mesure de toutes les régions et cliquez sur mesure pour obtenir le nombre des foyers dans l&#39;ensemble des noyaux correspondant dans l&#39;image Haut-Hat. </li><li> Le nombre des foyers de chaque région peut être exporté dans un fichier MS-Excel en utilisant l&#39;option log-données. </li></ol> 3Dreconstruction d&#39;images Pour créer une image 3D à partir d&#39;une pile utilisant Metamorph: <ol><li> Allez dans le menu et choisissez pile de reconstruction 3D. </li><li> Sélectionnez l&#39;angle de rotation (par exemple 160 °, 320 °). </li><li> Sélectionnez la reconstruction 3D de type maximum. </li><li> Choisissez le plan de rotation (horizontale ou verticale). </li><li> Choisissez la distance Z-étalonnage. </li></ol> Il est préférable d&#39;utiliser l&#39;utilisateur spécifié Z-distance (optimal est de 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Choisissez OK pour créer une reconstruction 3D. </li></ol> Ligne de balayage d&#39;analyse Pour l&#39;analyse de scan en ligne en utilisant Metamorph: <ol><li> Ouvrez soit une image plane unique ou d&#39;un fichier empilés. </li><li> Allez à la commande de mesure outil de bars et de sélectionner l&#39;analyse scan en ligne. </li><li> Tracez une ligne sur la cellule et cela va automatiquement révéler l&#39;intensité de fluorescence et de la distance de chaque marqueur sur le chemin de la ligne. </li></ol> Pour élucider les relations spatiales de marqueurs chromatine différentes, par exemple, γH2AX foyers et la méthylation des histones, il est préférable de tracer des lignes qui couvrent les régions qui sont à la fois dense et pauvre en ces marqueurs. Les données représentant Aux fins de cette démonstration, nous avons utilisé des anticorps contre γH2AX foyers et à H3K4me, pour évaluer la distribution spatiale des CDB à un déterminant épigénétique de la transcription activement euchromatine. Comme le montre la figure 1, après irradiation avec 2GY, γH2AX foyers formés principalement dans les régions qui ont été ternes pour les deux taches H3K4me et pour le colorant ADN TOPRO-3 (vive les régions d&#39;ADN tachés sont indicatifs de l&#39;hétérochromatine). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. ΓH2AX foyers à prédominance dans l&#39;euchromatine, en réponse aux radiations ionisantes. (A) de visualisation par immunofluorescence de γH2AX foyers (en vert) chez l&#39;homme érythroleucémique K562, 1 heure après γ-irradiation (2 Gy). γH2AX foyers sont indiquées par rapport à H3K4me, représentant activement transcrire euchromatine (rouge). L&#39;ADN est étiqueté avec TOPRO-3 (bleu). L&#39;image fusionnée (bleu, rouge et vert) montre l&#39;exclusion γH2AX foyers de régions hétérochromatiques. L&#39;analyse de balayage de ligne (fluorescence à distance vs intensité) indique la répartition relative des marqueurs dans un seul plan. (B) Tranches à des plans différents de la reconstruction 3D de l&#39;image fusionnée décrit ci-dessus.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Une réponse précoce moléculaires de l&#39;ADN double-brin (CDB) est la phosphorylation de la Ser-139 résidus dans le motif de SQEY terminale de l&#39;histone H2AX 1,2. Cette phosphorylation de H2AX est médiée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) famille de protéines, de l&#39;ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR) 3. La forme phosphorylée de H2AX, dénommé γH2AX, se répand dans les régions adjacentes de la chromatine sur le site de l&#39;ORD, formant des foyers distincts, qui sont facilement visualisés par microscopie à 3 immunofluorecence. Analyse et quantification de γH2AX foyers a été largement utilisé pour évaluer la formation et la réparation ORD, en particulier en réponse aux rayonnements ionisants et pour évaluer l&#39;efficacité de rayonnement différents composés et modifiant composés cytotoxiques 4. Compte tenu de la spécificité et la sensibilité exquise de ce marqueur de novo de CDB, il a fourni de nouvelles perspectives dans le processus d&#39;endommagement de l&#39;ADN et la réparation dans le contexte de la chromatine. Par exemple, en radiobiologie le paradigme central est que l&#39;ADN nucléaire est la cible critique à l&#39;égard de la sensibilité aux rayonnements. En effet, le consensus général dans le domaine a été largement pour voir la chromatine comme un modèle homogène pour dommages à l&#39;ADN et la réparation. Cependant, avec l&#39;utilisation de γH2AX comme marqueur moléculaire de la CDB, une disparité dans γ-irradiation formation γH2AX foyers dans l&#39;euchromatine et l&#39;hétérochromatine a été observé 5-7. Récemment, nous avons utilisé un panel d&#39;anticorps mono-, di-ou tri-méthylé histone H3 lysine 9 au (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), qui sont empreintes épigénétiques de l&#39;hétérochromatine constitutive et le silencing transcriptionnel et lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), qui sont étroitement corrélées activement transcrire régions euchromatiques, pour étudier la distribution spatiale des rayonnements ionisants γH2AX suivantes 8. En conformité avec les idées dominantes sur la biologie de la chromatine, nos résultats montrent une corrélation étroite entre la formation et la transcription γH2AX actif 9. Ici nous démontrons notre méthode d&#39;immunofluorescence pour la détection et la quantification des γH2AX foyers dans des cellules non adhérentes, avec un accent particulier sur la co-localisation avec d&#39;autres marqueurs épigénétiques, analyse d&#39;image et de modélisation 3D.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Spatial Distribution of Î³H2AX following Ionizing Radiation at JoVE.com

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

L&#39;analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l&#39;ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d&#39;évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K vues.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Vidéo: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Recherche

Biologie

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analyse des SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Et la traite des cellules humaines

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;utilisation de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagerie entier orgue et histologie tissulaire quantitative du Bio-distribution des molécules marquées par fluorescence

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Dosimétrie pour l’irradiation cellulaire à l’aide d’installations de radiographie Orthovoltage (40-300 kV)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...