Ce travail est soutenu par des subventions de recherche du National Institutes of Health (HL068915; HL088206) et les contributions au Fonds de la conduction cardiaque au Centre hospitalier pour enfants de Boston.

Partie 1: Préparer les solutions et le système coeur isolé perfusé <ol><li> Le matin de l&#39;expérience, L 4,0 de Krebs-Henseleit solution est préparée comme décrit précédemment [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) est dissous dans 1,0 L de Krebs-Henseleit solution décantée du perfusat préparé à l&#39;étape 1.1. </li><li> Un montant supplémentaire de 150 ml de Krebs-Henseleit est retiré de la perfusat préparé à l&#39;étape 1.1 et mélangé avec 5 mol / L di-8-ANEPPS (dilué à partir d&#39;un 10 mmol / L des stocks dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)). </li><li> Ces trois solutions sont transférés à chemise d&#39;eau en verre réservoirs (Radnoti) où ils sont pré-chauffé à 41,0 ° C et oxygéné avec un bulleur submergé (Radnoti) à l&#39;aide de 0,2 um-filtrée à 95% d&#39;O 2; 5% de CO 2 gazeux. Solutions à partir des 3 réservoirs de stock sont pompés vers le système mural de Langendorff avec Masterflex ™ L / S pompes péristaltiques et de faible absorption de tube en silicone (Cole-Parmer). </li><li> Avant le montage, le système de Langendorff verrerie (Radnoti) est méticuleusement lavées avec E-TOXA-CLEAN réactif (Sigma-Aldrich) et rincés à fond avec 0,1 M / L HCl, 100% d&#39;éthanol et d&#39;eau distillée. </li><li> L&#39;appareil de Langendorff sans recirculation a été construit pour fournir 70 mm Hg à pression constante de 3 réservoirs séparés oxygénée, qui sont séparés du cœur avec les serpentins de chauffage à chemise d&#39;eau et les pièges à bulles (Radnoti) [7]. Les trois lignes de perfusion indépendantes convergent au-dessus du coeur à deux robinets à 3 voies, nous permettant de contrôler précisément la livraison des solutions préparées dans les étapes 1.1 à 1.3. Chemise d&#39;eau verrerie est connecté en série avec tube MASTERFLEX BPT PharMed (Cole-Parmer) et chauffé à 39 ° C avec de l&#39;eau distillée en utilisant deux circulateurs E100 (Lauda). La perte de chaleur par le tube de silicone traité au platine (Cole-Parmer) qui relie les réservoirs à pression tête pour les serpentins de chauffage et de pièges à bulles abouti à un 37 ° C perfusat d&#39;atteindre le coeur. </li></ol> Partie 2: Récolte du coeur de rat et de mettre en place une perfusion de Langendorff <ol><li> Pour provoquer une profonde anesthésie générale dans 200 à 250 g chez le rat Lewis, 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine est injecté dans la cavité péritonéale. A ce mélange, on ajoute 500 U / kg d&#39;héparine pour éviter la coagulation du sang et l&#39;ischémie myocardique durant la procédure d&#39;explantation. </li><li> Pour un accès facile vers le cœur et gros vaisseaux, la paroi thoracique antérieure est retirée. Après cela, les tissus environnants est soigneusement disséquée et le sac péricardique ouvert. </li><li> Après identification de la veine cave inférieure, ce navire est ligaturé avec de la soie 5-0 (Ethicon) et de l&#39;ensemble cœur-poumon bloc est explanté. Tissulaire est immédiatement placé dans glacée de Krebs-Henseleit solution contenue dans un bécher de 50 ml sur la glace. </li><li> L&#39;aorte ascendante est rapidement identifié et disséqué par les tissus environnants. Une taille appropriée canule (Harvard Apparatus) est inséré dans l&#39;aorte, en prenant soin d&#39;éviter d&#39;interrompre la perfusion obligatoire des artères coronaires en insérant la canule trop loin dans la racine aortique. La canule est fixée au aorte ascendante avec de la soie 5-0 (Ethicon). </li><li> Le coeur de rat est alors placé sur l&#39;appareil de Langendorff sans introduire de bulles d&#39;air dans la canule. Rétrograde perfusion coronaire vasculaire est désormais établi avec la chaleur, oxygénée de Krebs-Henseleit solution à partir de la pression de tête décrite à l&#39;étape 1.6. </li><li> Tissulaire supplémentaire, y compris les poumons, est désormais supprimé et le coeur est perfusé pendant 20 minutes afin de permettre la récupération de la fonction et à stabiliser le rythme. Pendant ce temps, une sonde de température très mince thermocouple (Cole-Parmer) est introduit dans la cavité ventriculaire gauche et suturé en place avec 5-0 Prolène suture (Ethicon). La sonde est reliée à un thermo-régulateur (Digi-Sense) pour s&#39;assurer que la température du cœur est maintenue à 37 ° C en ajustant les paramètres de la pompe de circulation d&#39;eau. Motion à partir perfusat dégoulinant de l&#39;apex cardiaque est minimisé en plaçant un morceau de gaze dans le récipient d&#39;effluents. </li></ol> Partie 3: coeur de charge avec un colorant potentiométrique et d&#39;acquérir des signaux électroencéphalographiques et optiques <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) est chargé dans le cœur par le passage à la ligne de perfusion contenant le mélange de Krebs-Henseleit avec le colorant fluorescent à l&#39;aide d&#39;un robinet. De plus, une canule 18G est placé dans l&#39;oreillette gauche et / ou à droite et 50 ml supplémentaires de solution de colorant est lentement administré dans chacune de ces chambres, car ils ne sont pas suffisamment perfusé avec un colorant introduit dans les artères coronaires. </li><li> Pendant la procédure de chargement, 3 dérivations (Harvard Apparatus) sont délicatement placés sur la surface du cœur qui n&#39;est pas face à l&#39;optique utilisée pour la cartographie. Electrode n o 1 est positionné sur la partie postérieure apicale du ventricule gauche, n o 2 sur l&#39;oreillette gauche, et N <su<html> p&gt; o 3 comme une électrode de référence sur la racine aortique (figure 1). Les signaux auriculaires et ventriculaires électrographique sont ensuite amplifiés, numérisés et affichés à côté des signaux optiques en utilisant le logiciel (redshirt Imaging) (figure 2). Un oscilloscope (Tektronix TDS modèle 1002) est également utilisée pour visualiser l&#39;ECG de surface s en temps réel et d&#39;assurer une stimulation adéquate. </li><li> ECG amplificateur (Hugo Sachs Elektronik) paramètres: Filtre passe-haut: 0,1 Hz Filtre passe-bas: 150 Hz </li><li> La caméra CMOS (redshirt Imaging) et macroscope est positionné en utilisant les réglages XYZ afin que la surface du cœur est au point et centré dans le cadre d&#39;acquisition. La caméra et l&#39;optique sont montés sur une table anti-vibrations (Minus K Technology) afin de minimiser les fréquences de résonance. Dans le même temps, la stimulation d&#39;une électrode coaxiale (Harvard Apparatus) contrôlé par un cas isolé, S48-stimulation électrique unitaire (herbe), est placé sur l&#39;oreillette droite et le cœur est au rythme de 300 battements par minute (figure 1). </li><li> Stimulation électrique (Grass) paramètres: Tarif: 5 impulsions par seconde Délai: 0,2 ms Durée: 2 ms Volts: 6-12 V Mode: Répéter Pulse: Simple </li><li> Pour les enregistrements optiques qui manquent les artefacts de mouvement de la contraction, le cœur doit être découplée électromécanique. Nous faisons cela en commutation à nouveau les lignes de perfusion de Krebs-Henseleit solution qui contient 11 mmol / L BDM. Entre les acquisitions, le coeur est perfusé avec inaltérée de Krebs-Henseleit pour aider à préserver la viabilité de la préparation. </li><li> Les paramètres d&#39;enregistrement sont fixés à l&#39;aide du logiciel (imagerie redshirt) avec les paramètres d&#39;acquisition suivants: Configuration: 2000 Hz; 128x128 matrice de pixels Intervalle de trame: 0,5 ms Gain Amplificateur Appareil photo: 5x On-Chip Gain: 8x-12m ² bien- Obturateur: 500 ms de retard Nombre de cadres: 4000 Durée: 2000 ms </li><li> Toutes les lumières de la pièce et les équipements sont hors tension ou blindés pour éliminer le bruit de fond pendant l&#39;enregistrement. La lumière s&#39;allume au coeur uniquement pendant l&#39;enregistrement optique de réduire la photo-blanchiment et la toxicité de teinture. L&#39;obturateur source de lumière est contrôlée avec une impulsion de 5 V livré via le panneau de contrôle au moyen d&#39;un D-à-Un conseil à l&#39;ordinateur (imagerie redshirt). </li></ol> Partie 4: Analyser les informations d&#39;acquisition à l&#39;aide du logiciel d&#39;imagerie redshirt <ol><li> Suite à l&#39;acquisition, les données sont traitées en utilisant différents paramètres de filtre. Nous utilisons généralement les paramètres par défaut sauf si l&#39;ajustement de la bande d&#39;arrêt / filtre passe, qui est fixé avec la limite à gauche à 44,0 et la limite à droite à 98,0. Plus tard, les informations enregistrées sont traitées et un film est généré (imagerie redshirt). </li><li> Les données provenant d&#39;une acquisition correspond à l&#39;activation locale électrique à 16 384 sites sur la surface du coeur sur une période de 2 secondes. Le logiciel permet à ces signaux locaux d&#39;être directement comparés entre eux et avec les enregistrements électroencéphalographiques auriculaire et ventriculaire. Les données sont ensuite visualisées par une cartographie locale activation électrique de la couleur et le rendu cette information comme une animation montrant l&#39;activation spatio-temporelle électrique sur la surface cardiaque. Pour créer une telle animation, nous utilisons le logiciel pour: <ul><li> temporellement et / ou filtrer les données spatialement </li><li> Sélectionnez une heure de début et de fin pour l&#39;animation </li><li> signaux optiques carte de la couleur selon l&#39;intensité lumineuse de chaque pixel de repos </li><li> superposer les données couleur résultante avec une image du cœur </li><li> générer l&#39;animation </li></ul></li></ol> Partie 5: Les résultats représentatifs Si la préparation du cœur perfusé était immobile pendant l&#39;enregistrement, les signaux optiques montrent un pic distinct pour chaque pixel impliqués dans un changement de l&#39;intensité des émissions de di-8-ANEPPS. Les films correspondants (Figures 3 et 4) montrent un front d&#39;onde d&#39;excitation se propager sur toute la surface épicardique du cœur ainsi que les enregistrements électroencéphalographiques acquises simultanément (Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Une photographie d&#39;une préparation de Langendorff perfusé coeur illustrant les positions de l&#39;électrode de stimulation sur l&#39;oreillette droite et l&#39;ECG conduit comme décrit dans l&#39;étape 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /> Figure 2. Représentant des signaux optiques et des enregistrements électroencéphalographiques d&#39;un coeur de rat perfusé Lewis. Le panneau A montre une image de la surface épicardique utilisés pour l&#39;imagerie optique. La position des pixels choisis pour démontrer les changements dans l&#39;émission de fluorescence au cours du temps dans le groupe B sont indiquées par des flèches colorées. Signaux électroencéphalographiques sont présentés dans le Panneau de C avec la ligne rouge indiquant l&#39;activation auriculaire et la ligne de lumière bleue qui correspond au signal ventriculaire. S&#39;il vous plaîtve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt; cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l&#39;Hôpital pour enfants de Boston.

L&#39;ablation du cœur de rats anesthésiés doivent être effectués rapidement pour éviter une ischémie myocardique. Si la perfusion d&#39;ischémie coronarienne ou insuffisance se produit, le coeur se développeront probablement des arythmies et peut devenir un infarctus. En outre, ces coeurs montrera insuffisante émission de fluorescence pour les enregistrements informatifs et des analyses ultérieures. Avant de charger le colorant, les cellules du myocarde doivent être adéquatement perfusés avec une solution...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

Cartographie optique de la surface cardiaque avec sensibles au voltage colorants fluorescents est devenu un outil important pour étudier l&#39;excitation électrique dans des modèles expérimentaux qui vont à l&#39;échelle de cultures de cellules d&#39;organes entiers<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Utiliser l&#39;état de l&#39;art des systèmes d&#39;imagerie optique, la génération et la propagation des potentiels d&#39;action au cours du rythme cardiaque normal ou long initiation et le maintien des arythmies peuvent être visualisées presque instantanément<sup&gt; [1]</sup&gt;. Le dernier disponible dans le commerce de systèmes peuvent fournir des informations à très haute résolution spatio-temporelle et étaient basées sur matériel conçu initialement développé pour surmonter les obstacles imposés par plus conventionnelles des méthodes électrophysiologiques<sup&gt; [1]</sup&gt;. Les progrès de la haute résolution et haute vitesse Complementary metal-oxyde-semiconducteur (CMOS) caméras et intensément-lumineux, les diodes électroluminescentes (LED) ainsi que la tension des colorants sensibles, l&#39;optique, et les filtres ont commencé à faire l&#39;acquisition de signaux électriques pratique pour les biologistes cellulaires cardiovasculaires qui sont plus habitués à travailler avec des microscopes. Bien que la nouvelle génération de caméras CMOS peut acquérir 10 000 images par seconde sur une matrice de pixels 16 384, selon le type de préparation des échantillons, établi de longue date des technologies d&#39;acquisition de fluorescence tels que des barrettes de photodiodes, systèmes laser à balayage, et refroidi à couplage de charge (CCD caméras) ont encore des avantages distincts par rapport à la gamme dynamique, rapport signal-bruit, et l&#39;efficacité quantique<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Dans la présente étude, des coeurs de rats ont été perfusés Lewis<em&gt; Ex vivo</em&gt; Avec un perfusat cristalloïdes (Krebs-Henseleit solution) à 37 ° C sur un appareil de Langendorff modifié. Après une période de stabilisation de 20 minutes, les cœurs étaient par intermittence perfusés avec 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime pour éliminer la contraction associée mouvement pendant l&#39;acquisition des images. Pour la cartographie optique, nous avons chargé les cœurs avec la sonde à réponse rapide potentiométrique di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) et brièvement illuminé la préparation avec 475 ± 15 nm lumière d&#39;excitation. Lors d&#39;une deuxième période typique 2 de l&#39;éclairage, la lumière&gt; 605 nm émise par la préparation cardiaque a été imagé avec un appareil photo CMOS haute vitesse connecté à un macroscope horizontale. Pour cette démonstration, les cœurs étaient rythme à 300 battements par minute avec une électrode coaxial connecté à une unité de stimulation électrique isolé. Simultanée des enregistrements électroencéphalographiques bipolaires ont été acquises et analysées avec les signaux de tension en utilisant un logiciel facilement disponible. De cette manière, les potentiels d&#39;action sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff peut être visualisé et enregistré avec des signaux électroencéphalographiques.

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l&#39;image mouvement d&#39;action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K vues.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l'image mouvement d'action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Vidéo: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

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Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.