Le protocole actuel peut servir de nouvelle plate-forme pour l’étude et le développement des porteurs de drogue pour cibler des emplacements de la maladie dans le système vasculaire humain. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet l’étude de l’accumulation de porteurs de médicaments à l’intérieur d’un modèle artériel 3D répliqué par l’homme. Cela se fait dans des conditions physiologiques, y compris la circulation sanguine.
Cette approche peut être utilisée pour optimiser les porteurs de médicaments pour le diagnostic et le traitement d’un large éventail de maladies vasculaires, y compris les artères athérosclérotiques. Commencez par sélectionner des images de patients ou des géométries précédemment étudiées de la bifurcation humaine de l’artère carotide et utilisez les images pour créer un modèle de conception assistée par ordinateur du moule. Utilisez une imprimante 3D pour imprimer le dessin, retirez les supports d’impression temporaires et rincez le modèle avec de l’acétone avant d’utiliser du papier de verre pour polir et lisser les moules, en particulier les zones à partir desquelles les supports ont été coupés.
Après le ponçage, rincez le modèle avec de l’alcool isopropylique pour éliminer toute poussière plastique et laissez le modèle sécher dans une hotte chimique pendant deux à trois heures. Pour faciliter la désillusion du plastique, vaporisez le modèle avec de la laque transparente trois fois, permettant à la laque de sécher à l’air pendant une heure entre les applications. Après la dernière application, utilisez un pinceau et une laque pour coller des bandes rectangulaires transparentes de plastique lisse de chaque côté du cadre, de sorte que le modèle soit scellé en bas et ouvert en haut.
Après séchage, placez le moule dans un dessicateur et pauvre en solution de caoutchouc de silicone fraîchement préparée dans l’ouverture. Retirez les bulles d’air jusqu’à ce que le mélange soit clair et laissez le moule à l’intérieur du desséchant pendant la nuit. Lorsque le mélange est complètement sec, retirez les lames transparentes et plongez le modèle dans de l’acétone absolue pendant 48 heures dans une hotte chimique jusqu’à ce que le plastique soit complètement dissous.
Pour évaporer l’acétone piégée avant l’ensemencement des cellules, incuber le modèle pendant au moins quatre jours à 60 degrés Celsius. Pour amorcer le modèle avec des cellules, stérilisez d’abord le modèle et deux connecteurs d’entrée et de sortie par lumière ultraviolette ou rayonnement. Après 20 minutes, à l’aide d’une seringue pour recouvrir le modèle de quatre millilitres de 100 microgrammes par millilittre de fibronectine pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, retirer la solution de fibronectine par la sortie et laver le modèle avec un milieu cellulaire endothélial. Utilisez une seringue pour remplir le modèle rincé avec quatre millilitres d’un 2,5 fois 10 à la sixième cellules endothéliales par millilitre de suspension cellulaire de milieu cellulaire endothélial et fixer le modèle à un rotateur à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire 48 heures à un tour par minute, pour assurer une distribution homogène des cellules. À la fin de l’incubation, utilisez une seringue en plastique de 10 millilitres pour laver le modèle avec du PBS.
Fixer les cellules pendant 15 minutes, avec quatre millilitres de paraformaldéhyde à 4%, puis laver le modèle trois fois avec du PBS comme démontré avant de stocker le modèle à quatre degrés Celsius dans quatre millilitres de PBS frais. Avant de commencer une expérience, utilisez le tube de sortie pour connecter un amortisseur d’oscillation connecté à une pompe péristaltique à l’entrée du modèle carotide cultivé et utilisez un morceau de tube pour fusionner les deux sorties. Ensuite, divisez le tube de sortie en deux tubes de sortie et ajoutez une pince en plastique à chaque tube.
Pour mettre en place une configuration en circuit fermé, ajouter 300 millilitres de PBS à un récipient en circuit fermé et placer un tube d’entrée et un tube de sortie à l’intérieur du récipient rempli de PBS avec les pinces B et C ouvertes, respectivement, puis placer l’autre tube d’entrée dans un récipient de lavage d’un litre rempli d’eau distillée, et l’autre tube de sortie dans un conteneur à déchets vide d’un litre avec les pinces A et D fermées, respectivement. Placez le modèle carotide sous un microscope stéréoscopique, réglez la pompe sur un débit de départ de 10 tours par minute, avec cinq tours par minute incrément augmente toutes les quatre à cinq minutes. Lorsque le débit atteint 100 tours par minute, ajoutez 1,6 microgramme de particules de polystyrène carboxylé fluorescent par millilitre de PBS au récipient en circuit fermé et imagez la région d’intérêt toutes les 10 secondes pendant une heure et demie.
Pour configurer une configuration de circuit ouvert, ouvrez les pinces A et D et fermez immédiatement les pinces B et C. Laissez la majeure partie de l’eau s’écouler du récipient de lavage vers le conteneur à déchets à 100 tours par minute. Avant que l’eau n’ait été complètement transférée, arrêtez la pompe et fermez les pinces du tube avant l’entrée et après la sortie du modèle carotide.
À l’aide des filtres appropriés, capturez des images du modèle dans la région d’intérêt pour montrer le dépôt et l’adhérence des particules aux cellules. À la fin de l’expérience, utilisez un code logiciel personnalisé pour analyser les images capturées dans la région d’intérêt, entrez le nom de l’image et définissez le seuil estimé. Exécutez ensuite le code.
Inspectez l’image résultante et le nombre compté de particules dans l’image. Dans cette analyse représentative, on peut observer des micrographies photo des cellules endothéliales cultivées ensemencées dans un modèle 3d d’artère carotide par brightfield et formation image microscopique confocale de fluorescence. Les billes de verre fluorescentes de 10 microns de diamètre, ensemencées dans le modèle 3D, présentaient un motif de recirculation, suggérant une imitation réussie des conditions physiologiques dans le modèle.
L’imagerie du dépôt de particules a révélé qu’un niveau plus élevé d’adhérence des particules aux cellules a été observé en dehors de la zone de recirculation où la contrainte de cisaillement de la paroi était élevée. Suivant ce protocole, des particules fonctionnalisées avec une cinétique de liaison spécifique et une culture de noyau de cellules dans différents modèles d’artère humaine peuvent être explorées pour améliorer le modèle et pour étudier des formulations spécifiques. Cette technique fournit une nouvelle plate-forme pour étudier le ciblage vasculaire des porteurs de médicaments.
Nous l’avons récemment utilisé pour montrer comment l’additivité des particules peut être adaptée pour cibler différentes régions de vaisseaux malades.
