Ce travail a été soutenu par le Prix National Science Foundation CARRIÈRE (0953583) et l&#39;Institut national de la santé NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Dans ce protocole, un oligonucléotide (RBMB1) a été marquée à son extrémité 5 &#39;avec un colorant rapporteur CF640R et a la séquence: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3&#39;. domaines auto-complémentaires, qui déterminent la formation de la structure en épingle à cheveux, sont en caractères gras. Le deuxième oligonucléotide (RBMB2) a été marqué à l&#39;extrémité 3 &#39;avec un extincteur Noir Iowa RQ-Sp et a la séquence: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. 1 Préparation de RBMBs <ol><li> Effectuer une rotation rapide des tubes contenant les RBMB1 et RBMB2 oligonucleotides, afin d&#39;assurer l&#39;oligonucléotide est séché à la partie inférieure du tube, et remettre en suspension dans l&#39;eau et de la DNase exempte de RNase à une concentration finale de 100 uM. Par exemple, un échantillon de 10 nmoles de l&#39;oligonucléotide doit être remis en suspension dans 100 ul d&#39;eau. </li><li> Measure de la concentration exacte des échantillons de RBMB1 RBMB2 licence et par spectroscopie UV-vis. <ol><li> Mélanger 3 pl de l&#39;échantillon de RBMB avec 117 ul de DPBS (sans calcium et magnésium) dans un microtube de centrifugation. </li><li> Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l&#39;absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible. </li><li> Calculer la concentration des stocks des échantillons de RBMB basées sur l&#39;absorbance à 260 nm (ou 650 nm pour RBMB1), en utilisant l&#39;équation: Stock Concentration (M) = A 260 * facteur de dilution / coefficient d&#39;extinction où A 260 est l&#39;absorbance à 260 nm et le facteur de dilution est de 40. Remarque: Le coefficient d&#39;extinction pour la RBMB se trouve sur la fiche technique fournie par le fabricant d&#39;oligonucléotides. Le coefficient de CF640R d&#39;extinction à 650 nm est 103000. </li></ol></li><li> Mélanger 20 pi de 100 uM RBMB1, 30 pl de 100 uM RBMB2, 6 pi 10x, Un tampon de phosphate (10x tampon phosphate 480 mM, K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) et 4 ul d&#39;eau et de la DNase sans RNase. Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min. Note: Ceci est généralement suffisante pour environ 50 études. </li><li> Préparer une colonne de chromatographie liquide en utilisant 75 Superdex qualité prép pour éliminer tous les oligonucléotides non hybridés RBMB2. Utiliser un 8 ml (0,7 x 20 cm) de colonne de chromatographie en phase liquide avec un volume de ~ 4 ml de lit de purifier le petit volume de sondes mixtes. </li><li> Laver et s&#39;équilibrer avec la Superdex ~ 50 ml de tampon phosphate de 1x en utilisant une pompe de seringue en cours d&#39;exécution à un écoulement à un débit de 0,6 ml / min. Avant tout le fluide pénètre dans le volume du lit, arrêter la pompe de la seringue, retirez-le, et laissez le liquide restant passent par la colonne par gravité. </li><li> Charger le mélange RBMB (60 pl) sur la colonne de chromatographie. <ol><li> Après que l&#39;échantillon de RBMB a complètemententrée dans le lit, ajouter lentement encore 250 ul de tampon phosphate de 1x à la partie supérieure du lit de sorte que tout l&#39;échantillon soit complètement entré dans la colonne. </li><li> Remplir la colonne de la jante avec un tampon de phosphate 1x. Fermer le haut, et démarrer la pompe de la seringue - la seringue doit être rempli avec ~ 50 ml PBS 1x et de fonctionner à un taux de 0,6 ml / min. </li><li> Une fois que le RBMB se rapproche de la partie inférieure de la colonne - l&#39;échantillon de RBMB peut généralement être facilement visualisé en raison de la couleur du colorant incorporé dans la sonde - recueillir le flux continu à deux gouttes par microtube (1,5 ml). Arrêter la collecte de l&#39;échantillon, une fois la couleur dans les microtubes devient clair. </li></ol></li><li> Mélanger les tubes contenant l&#39;échantillon de RBMB couleur - généralement 5-6 tubes - et charger dans un dispositif de filtre centrifuge (10 000 MW de coupure). Centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 RCF pendant 20 min ou jusqu&#39;à ce que le volume désiré. Remarque: Ces vitesses et les durées généralementobtenir un volume final de 30 ul ~. </li><li> Mesurer la concentration exacte de l&#39;échantillon de RBMB purifié par spectroscopie UV-Vis. <ol><li> Prendre 3 ml de l&#39;échantillon de RBMB concentrée et mélanger avec 117 DPBS ul dans un tube à centrifuger. </li><li> Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l&#39;absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible. </li><li> Calculer la concentration de l&#39;action de la RBMB hybride basé sur l&#39;absorption à 650 nm, en utilisant l&#39;équation: Stock Concentration (M) = A 650 * facteur de dilution / coefficient disparu où A 650 est l&#39;absorbance à 650 nm, le facteur de dilution est de 40. Remarque: Le coefficient d&#39;extinction pour CF640R à 650 nm est de 103.000 et le coefficient d&#39;extinction pour l&#39;Iowa noir RQ est ~ 20000. Les coefficients d&#39;extinction sont additives et ne sont pas sensibles à l&#39;hybridation. Par conséquent, l&#39;échantillon de stock RBMB a un coefficient d&#39;extinction combiné de approximately 123 000 à 650 nm. </li></ol></li><li> Etiqueter le tube de façon appropriée avec le nom et la concentration et conserver à -20 ° C pour une utilisation future. </li></ol> 2 Préparation de poly-D-lysine couché 8 bien chambré lamelle couvre-objet <ol><li> Préparer une solution à 0,2 mg / ml de poly-D-lysine par dissolution de 5 mg de poly-D-lysine (poudre lyophilisée, g irradié) dans 25 ml d&#39;eau stérilisée dans un environnement stérile. </li><li> Ajouter 200 ul de l&#39;/ ml de solution de poly-D-lysine 0,2 mg dans chaque puits d&#39;une lamelle de 8 puits à chambre, dans un environnement stérile. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 16 à 18 heures sous la hotte de culture cellulaire. </li><li> Aspirer la Poly-D-lysine et laver le bien 3 fois avec de l&#39;eau distillée stérile. Remarque: Les diapositives de la chambre enrobés peuvent être conservés à 4 ° C. </li></ol> 3 Sonde livraison Remarque: Le système cellulaire utilisé doit contenir un gène chimère intégré qui exprime l&#39;ARN avec au moins 4 séquentielle bindtion des sites pour la RBMB dans la région 3 &#39;non traduite (UTR). Les séquences cibles doivent être complémentaires à la boucle de la RBMB. Il est conseillé que comme contrôle négatif, la même lignée de cellules est conçu pour exprimer la même construction génétique, mais sans les répétitions en tandem. Dans ce protocole, une lignée cellulaire de fibrosarcome humain HT1080, a été modifiée pour exprimer l&#39;ARN de GFP avec 96 répétitions en tandem de la séquence cible d&#39;RBMB dans la 3&#39;-UTR. La lignée cellulaire de commande a été conçu pour exprimer un ARN de GFP de type sauvage. <ol><li> cellules de plaque dans une fiole de T25 à 40-50% de confluence un jour avant la livraison de la sonde. Culture des cellules avec du milieu DMEM supplémenté avec 1% de pen / strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, allumer le microporateur et configurer les paramètres de microporation à 950 V, 2 impulsions, 25 ms. Note: Ces paramètres ont été optimisés pour les cellules HT1080, mais ils sont d&#39;un type cellulaire dépendante et peut être adjusted pour d&#39;autres types de cellules comme décrit dans les instructions du fabricant. </li><li> Remplir le tube de microporation avec 4 ml de tampon électrolytique et placez-le sur la station de microporation. </li><li> Sortez le stock échantillon de RBMB purifié et dégivrer. Diluer plusieurs microlitres à une concentration finale de 12 uM avec du tampon phosphate de 1x. 1 ul sont nécessaires pour chaque microporation. </li><li> Introduire à la pipette 1 ml de milieu de culture avec du FBS, sans antibiotiques, mais dans un tube à centrifuger. Remarque: Il sera utilisé pour les cellules en suspension immédiatement après microporation et peut être annulée, à proximité du dispositif de microporation, pour le moment. L&#39;inclusion d&#39;antibiotiques dans les milieux de culture diminue la viabilité des cellules après microporation. </li><li> Retirer les milieux de culture cellulaire à partir des cellules HT1080 modifiées (60-80% de confluence), laver les cellules avec 1 ml de Ca2 + et Mg2 + Les DPBS -Free une fois, et on incube avec 1 ml de trypsine pendant 1-2 min. </li><li> Arrêtez le trypsinization en ajoutant 1 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, des antibiotiques et sans rouge de phénol, et transférer les cellules dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Centrifuger les cellules dans le tube à centrifuger à 200 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant, remettre en suspension et mélanger les culots de cellules dans un volume final de 1 ml de DPBS. </li><li> Prenez 10 ul de la suspension cellulaire bien mélangé et compter les cellules. </li><li> Introduire à la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois pour s&#39;assurer qu&#39;ils sont bien dispersés et transférer 300 000 cellules avec DPBS dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min. </li><li> Eliminer le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le culot cellulaire. Reprendre le culot dans 11 ul de tampon de remise en suspension et la pipette de haut en bas plusieurs fois pour s&#39;assurer que les cellules sont bien dispersées. Veillez à ne pas générer des bulles d&#39;air. Remarque: Les bulles d&#39;air vont provoquer une étincelle pendant microporation et aboutir à la livraison de RBMB pauvres et la mort cellulaire. </li><li> Ajouter 1 pl de la RBMB dilué (12 M) et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Encore une fois veiller à ne pas générer des bulles d&#39;air. </li><li> Aspirer 10 pl du mélange RBMB-cellule, à l&#39;aide de la pipette de microporation, et insérer la pipette dans le tube de microporation. Appuyez sur le bouton start pour démarrer le microporation. Remarque: Il doit y avoir aucune bulle d&#39;air visibles dans la pointe. </li><li> Lorsque l&#39;écran de la montre microporateur fin, retirer la pipette de la gare, expulser le mélange de 10 pi dans le tube à centrifuger qui a été préparé plus tôt, avec 1 ml de milieu de culture avec du FBS mais sans antibiotiques. Mélanger doucement en faisant basculer le tube d&#39;un côté à côté à plusieurs reprises. </li><li> Faites tourner les cellules à 200 g pendant 5 min et laver les cellules deux fois, dans 1 ml de phénol rouge milieu de culture sans FBS avec mais sans antibiotiques, pour enlever les RBMBs qui n&#39;ont pas été livrés dans les cellules. Remettre en suspension avec 400 ul de phénol milieu de culture sans rouge avec du FBS mais sansantibiotiques. </li><li> Plate cellules micropore dans la lamelle revêtue de 8 puits chambré à 200 ul par puits ou à la confluence souhaitée Poly-D-lysine. </li><li> Facultatif: Si il est souhaitable de l&#39;image du noyau, ajouter Hoechst 33342 à des cellules à une concentration finale de 0,01 mg / ml. </li><li> Placez les lamelle chambré dans un incubateur de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant 1-2 heures avant l&#39;imagerie, de sorte que les cellules aient suffisamment de temps pour s&#39;installer sur la surface de la lamelle. Remarque: L&#39;imagerie peut être effectuée dès 30 min post-microporation. </li></ol> 4 Image Acquisition <ol><li> Allumer le système supérieur d&#39;incubation en direct de l&#39;étage de cellule et s&#39;équilibrer jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne 37 ° C, 5% CO 2 et 75% d&#39;humidité. </li><li> Allumez la source de lumière microscope et fluorescent et ouvrir le logiciel Metamorph. Remarque: Les autres logiciels similaires pour le contrôle de microscope et d&#39;acquisition d&#39;image peuvent également être utilisés. </li><li> Appliquer de l&#39;huile Immersol à l&#39;objectif. </li><li> Transférer la lamelle chambré avec des cellules micropore au système haut d&#39;incubation en direct au stade de cellule. Incuber le système d&#39;étape haut jusqu&#39;à ce que la température et la concentration de CO 2 sont stabilisées. </li><li> Ouvrez l&#39;onglet Acquérir, dans le logiciel Metamorph. Cliquez sur le bouton Show Live de trouver le terrain, la mise au point sous une lumière blanche et cliquez sur le bouton Stop Live. </li><li> Sous l&#39;onglet Acquisition, cliquez sur le bouton et ouvrir de pop-up acquisition de flux, et de configurer les paramètres d&#39;acquisition de films souhaités. Acquérir 150 images en utilisant le filtre Cy5 / CF640R et enregistrez les images sur le disque dur. </li></ol>

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J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr Mark Behlke et le Dr Ling Huang sont employés par IDT qui offre des oligonucléotides à vendre proche de certains des composés décrits dans le manuscrit. IDT est, cependant, pas une société cotée en bourse et ils ne possèdent pas personnellement des actions / fonds propres dans IDT.

La capacité d&#39;une seule image de transcription d&#39;ARN dans des cellules vivantes modifiées à l&#39;aide d&#39;un microscope à champ large classique nécessite un signal lumineux fluorescent et photostable à être associée à chaque produit de transcription d&#39;ARN et un faible bruit de fond de fluorescence émanant de sondes fluorescentes non liés. Dans ce procédé, un signal lumineux fluorescent est obtenu par hybridation multiple (jusqu&#39;à 96) des sondes fluorescentes à base d&#39;oligonucléotid...

L&#39;expression et la régulation des transcrits d&#39;ARN est un processus complexe et dynamique qui est en grande partie responsable de contrôler le comportement des cellules et sort. Bien que l&#39;importance de l&#39;ARN dans la fonction des cellules dicter est connue depuis un certain temps, il est souvent difficile d&#39;établir des liens clairs entre les deux puisque la plupart des outils d&#39;analyse de l&#39;ARN n&#39;ont pas la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer les événements réglementaires importants tels que la transcription éclatement, de l&#39;ARN la traite, et le traitement de l&#39;ARN localisée. Cela a conduit à l&#39;apparition de plusieurs techniques qui permettent de transcription d&#39;ARN différents à être visualisés dans des cellules vivantes en temps réel 1. Peut-être le plus important de ces techniques utilise une protéine de fusion GFP-MS2 à l&#39;ARN cible qui a été modifié pour contenir des répétitions en tandem du site de liaison de MS2 dans la 3&#39;-UTR de 2,3. En apportant de multiples molécules de GFP en proximité, transcrits d&#39;ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes brillantespar microscopie de fluorescence. Le système GFP-MS2 a fourni un aperçu sans précédent sur ​​le comportement de l&#39;ARN, y compris la visualisation directe et mesures de transcription éclatement 4,5, la détection de la localisation et de la transformation 6-9 uniques sub-cellulaire et l&#39;imagerie en temps réel du transport de l&#39;ARN 10. Cependant, en dépit de l&#39;énorme potentiel du système GFP-MS2, des protéines de fusion GFP-MS2 non liés peuvent créer un signal fluorescent de fond élevé qui limite la polyvalence et la gamme dynamique de cette technique. Plusieurs approches ont été développées pour limiter ce signal de fond, y compris le cloisonnement subcellulaire de la GFP-MS2 non lié 10, fragment de protéine complémentation 11, et des protéines de liaison d&#39;ARN et d&#39;autres cibles 12. Cependant, toutes ces approches restent sensibles à l&#39;expression relative et totale de l&#39;ARN cible et GFP-MS2 protéine de fusion. A titre d&#39;unLTERNATIVE aux systèmes GFP-MS2, les balises moléculaires ont également été utilisées pour détecter des transcrits d&#39;ARN modifiées avec des répétitions en tandem du site de liaison complémentaire à l&#39;extrémité 3 &#39;UTR 13,14. Les balises moléculaires sont des sondes oligonucléotidiques formant épingle à cheveux qui sont marqués à une extrémité avec un agent d&#39;extinction et à l&#39;autre extrémité avec un rapporteur fluorescent. Quand il n&#39;est pas lié à l&#39;ARN cible le rapporteur fluorescent et un extincteur rester à proximité, ce qui entraîne un état de faible fluorescent. Lors de l&#39;hybridation, le rapporteur fluorescent et extincteur sont écartées et la fluorescence est rétabli. Similaire au système GFP-MS2, la liaison de balises moléculaires multiples sur un seul résultat de la transcription de l&#39;ARN dans un endroit lumineux fluorescent qui peut être identifiée par microscopie à fluorescence; cependant, la fluorescence de fond devrait être beaucoup plus faible, en raison de la configuration de trempe balises moléculaires non liés. Malheureusement, malgré le mécanisme d&#39;activation intelligente qui est incorporé dans la mconception de balise olecular, il ya maintenant plus de preuves que non hybridée balises moléculaires ne restent pas dans la conformation en épingle à cheveux lorsqu&#39;il est introduit dans des cellules vivantes. Par conséquent, ils génèrent un signal de faux-positifs, qui réduit de manière significative le rapport signal sur fond. Pour pallier cet inconvénient, nous avons récemment développé une nouvelle sonde de synthèse de l&#39;ARN d&#39;imagerie des cellules vivantes, balises bimoléculaires ratiométriques (RBMBs; Figure 1A) 15,16. RBMBs sont composées de deux brins d&#39;oligonucléotides 2&#39;-O-méthyle qui forment une structure hybride avec des caractéristiques à la fois de l&#39;ARN court en épingle à cheveux (shRNA) et des balises moléculaires. Le mécanisme d&#39;activation de la boucle et la fluorescence est similaire à la balise moléculaire, tandis que le long double brin domaine avec un surplomb en 3 &#39;UU est plus caractéristique des shRNA. Les caractéristiques shRNA sont conçus pour conduire l&#39;exportation nucléaire, que nous avons trouvé une augmentation vie intracellulaire de&gt; 24 h, à la dégradation observable minimale, etempêche l&#39;ouverture non-spécifique de la boucle. En conséquence RBMBs présentent un fond signal-significativement plus élevé que les balises moléculaires. Il est à noter que RBMBs ne peut être préparé en utilisant des oligonucléotides d&#39;ADN, puisque les sondes à base d&#39;ADN ne possèdent pas les mêmes capacités d&#39;exportation nucléaires que des sondes à base d&#39;ARN. Structurellement, la boucle de RBMB est généralement conçue pour être comprise entre 15 et 21 bases de long, à créer un équilibre entre la spécificité et la sélectivité de l&#39;hybridation sur l&#39;ARN. La tige courte qui se forme à partir de deux domaines auto-complémentaires est généralement conçu pour être quatre bases. Si une tige plus longue est choisie, le taux d&#39;hybridation entre la boucle de RBMB et l&#39;ARN cible est significativement ralentie 17,18. A l&#39;inverse, quand une séquence de tige plus courte est sélectionnée, la température de fusion est souvent trop faible pour maintenir la structure tige-boucle à 37 ° C, conduisant à un signal de fond élevé. La spécificité de la RBMB est également rougeuced que la longueur de la tige est raccourcie. Depuis la séquence de la tige-boucle de RBMB peut également influer sur les performances de RBMB, il doit être soigneusement sélectionné 19. En particulier, les séquences de boucle idéal devrait avoir une structure secondaire minimale, s&#39;hybrider à des séquences d&#39;ARN avec une structure secondaire minimale, d&#39;éviter les sites de liaison de protéines, et éviter hors cible de liaison. Prédictions des deux RBMB et structure secondaire d&#39;ARN peuvent être obtenues en utilisant un logiciel tel que mfold 20. Sites complémentaires hors-cible peuvent identifiés à l&#39;aide d&#39;un nucléotide base locale Affectation outil de recherche (BLAST). Cependant, en raison d&#39;incohérences dans les prédictions du modèle et de la difficulté à identifier les sites de protéines Biding, la spécificité de tous les RBMBs doit finalement être validée expérimentalement. Si on le souhaite, un colorant de référence non éteint qui est insensible à l&#39;état d&#39;hybridation peut être ajouté à la RBMB 15. L&#39;addition d&#39;un colorant de référence peut prOvide un marqueur pour la livraison de la sonde et être utilisés pour l&#39;imagerie ratiométrique, si des mesures plus précises de fluorescence cellulaire total sont nécessaires. Les colorants de référence permet d&#39;ajuster les mesures de différences de fond dues aux variations de cellule à cellule dans la livraison. Cependant, lors de l&#39;imagerie de l&#39;ARN transcrits colorant individuel de référence n&#39;est pas nécessaire. Notamment, certains colorants de référence peuvent interférer avec l&#39;exportation de RBMBs à partir du noyau, ce qui conduit à un signal d&#39;arrière-plan légèrement plus élevée dans le noyau. Lorsqu&#39;ils sont bien conçus, RBMBs peuvent être utilisés pour l&#39;image des transcrits d&#39;ARN dans les cellules individuelles de vie simples, si l&#39;ARN cible est conçue pour contenir au moins quatre sites de liaison de RBMB (figure 1B) 16. RBMBs peuvent être efficacement délivrés dans une large gamme de types de cellules par l&#39;intermédiaire de microporation, avec peu ou pas d&#39;effet sur ​​la viabilité des cellules 21, et des mesures quantitatives de l&#39;expression de gènes peuvent êtreacquis dans les 30 minutes. De plus, la méthode est assez peu sensible à des niveaux de concentration de RBMB et ARN cible, étant donné que la fluorescence de RBMBs non liés est efficacement stoppée. Ici, nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour préparer et purifier RBMBs, ainsi que d&#39;un mode opératoire général pour la prestation de RBMBs en cellules vivantes par microporation et l&#39;imagerie des transcrits d&#39;ARN simples en temps réel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

La prise de conscience croissante que le règlement de temporelle et spatiale de l&#39;expression du gène peut avoir des conséquences importantes sur la fonction cellulaire a conduit au développement de diverses techniques de visualiser des transcrits d&#39;ARN dans les cellules individuelles de vie simples. Une technique prometteuse qui vient d&#39;être décrite utilise une sonde à base d&#39;oligonucléotide-optique, ratiométrique balise bimoléculaire (RBMB), pour détecter des transcrits d&#39;ARN qui ont été modifiées pour contenir au moins quatre répétitions en tandem de la séquence cible d&#39;RBMB dans la région 3 &#39;non traduite. RBMBs sont spécifiquement conçus pour émettre un signal fluorescent lumineux par hybridation à l&#39;ARN complémentaire, mais autrement, restent éteints. L&#39;utilisation d&#39;une sonde synthétique dans cette approche permet photostable, décalé vers le rouge, et des colorants organiques fortement émissifs à être utilisé pour l&#39;imagerie. La liaison de plusieurs RBMBs les ARN transcrits les résultats d&#39;ingénierie dans les points de fluorescence discrets lorsqu&#39;on les examine sous un microscope à fluorescence à champ large. Par conséquent, le mouvement de transcrits d&#39;ARN individuels peuvent être facilement visualisées en temps réel en prenant une série temporelle d&#39;images fluorescentes. Nous décrivons ici la préparation et la purification de RBMBs, la livraison dans les cellules par microporation et vivons-cellule imagerie de transcrits d&#39;ARN simple.

Peu de temps après la microporation de cellules HT1080 en présence d&#39;RBMBs, des transcrits d&#39;ARN individuels qui ont été modifiés pour contenir de multiples sites de liaison de RBMB à leur extrémité 3 &#39;UTR apparaissent des taches fluorescentes comme lumineuses lorsque imagé par l&#39;ensemble du domaine de la microscopie à fluorescence (figure 2). Alors que les transcrits d&#39;ARN individuelles avec les sites de liaison aussi peu que quatre de RBMB peuvent être visualisés dans l...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d&#39;ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l&#39;imagerie de fluorescence de transcrits d&#39;ARN simples en temps réel.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vues.  University of Pennsylvania.  Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel. 

Vidéo: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

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Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Mesure de la cinétique de la transcription d&#39;ARNm dans les cellules vivantes simples

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Application de Codé génétiquement fluorescent oxyde nitrique (NO •) Sondes, les geNOps, pour l&#39;imagerie en temps réel de NO • Les signaux dans les cellules simples

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sonder la cinétique de l’ARNm dans l’espace et le temps à Escherichia coli à l’aide de l’hybridation de fluorescence in situ à deux couleurs

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...