Ce travail a été financé par des subventions du NIH et de l&#39;ACS, y compris T32CA009135, CA133027, CA070723, CA022443 et. Le projet de loi Sugden est un professeur American Cancer Society Research.

1. Ingénierie des cellules avec des plasmides visibles <ol><li> Utilisez une digestion de restriction standard ou techniques de recombinaison homologue pour introduire un fragment d&#39;ADN contenant environ 250 copies de la séquence opérateur lactose (LACO) dans le plasmide pour être visualisées. Notre plasmide est un bacmide d&#39;environ 170 kpb et contenant le génome complet de sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès (KSHV) et la résistance à l&#39;hygromycine codé 12. </li><li> Présentez-Laco contenant de l&#39;ADN plasmidique dans les cellules de mammifères par transfection avec Lipofectamine 2000. Nous avons transfecté des cellules HeLa et SLK en boîtes de 60 mm pour 4 h avec 10 ug d&#39;ADN plasmidique purifié avec 25 ul de Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, et 3,5 ml de DMEM. </li><li> Changer le milieu de culture à 5 ml de DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin cellules et incuber pendant 48 h. </li><li> Plaque les cellules à faible densité dans de grands plats et des cellules de culture dans un milieu contenant un antibiotique de sélection pour l&#39;introduction plasmid; nous avons sélectionné les cellules dans du DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal avec 300 pg / ml d&#39;hygromycine pendant 3 semaines. </li><li> Utilisez des morceaux de stériles, la trypsine imbibé de papier filtre pour transférer hygromycine colonies résistantes à de nouvelles boîtes de culture. </li><li> Lorsque clones transfectés sont cultivés à remplir le récipient métallique, pour isoler l&#39;ADN digestion de restriction et de Southern blot en sorte que le polymère du plasmide lacO est homogène et de la taille attendue. </li><li> Si le plasmide n&#39;a pas été modifié pour exprimer une fusion de LacI, infecter clones appropriés avec un rétrovirus codant pour le répresseur lactose (LACI) fusionné à une protéine fluorescente rouge, comme LacI-tdTomato. Nous utilisons tdTomato plutôt que de protéines qui sont fluorescents rapprocher au vert pour réduire photoxicity qui se produirait à partir de multiples expositions plus longues durées 13. </li><li> Une fois la protéine de fusion est introduite LacI, la culture des cellules en présence de 200 ug / ml d&#39;isopropyl-bD-galactoside (IPTG) pour bloquer les protéines de fusion de liaisonADN. </li><li> Culture des cellules pendant au moins 3 jours pour permettre l&#39;expression de la protéine LacI-tdTomato. </li><li> Clones écran (en emportant l&#39;IPTG et la visualisation des cellules comme décrit ci-dessous) pour les personnes ayant des niveaux optimaux de LacI-tdTomato qui révèlent signaux distincts avec des niveaux de fond minimal de protéine de fusion non liée. </li></ol> 2. Développement du système d&#39;imagerie Notre système d&#39;imagerie se compose d&#39;un Zeiss Axiovert 200M équipé d&#39;une platine motorisée et le Plan-Aochromat 63x/1.4 objectif huile. La lumière d&#39;excitation de fluorescence est fourni par le &quot;blanc neutre&quot; d&#39;un système de LED Colibri. D&#39;émission est détecté par une CascadeII: 1024 EMCCD caméra. Il s&#39;agit d&#39;un refroidissement, la caméra de recul dilué avec un registre de gain pour amplifier des signaux, le courant d&#39;obscurité est 0,061 électrons par pixel par seconde, et l&#39;efficacité quantique est supérieur à 0,90. Le système est contrôlé par le logiciel AxioVision 4.8, y compris le module SmartExperiments. Pour la détection de tdTomad&#39;, nous utilisons un jeu de filtres Zeiss 75HE pour laquelle 85% de la lumière qui passe peut exciter le fluor et 95% de la lumière émise passeront le filtre d&#39;émission. <ol><li> Assembler un système de formation d&#39;image avec un microscope inversé et une caméra pour la détection sensible EMCCD de signaux, une source de lumière LED pour l&#39;excitation spécifique et rapide de coffrage, et une platine motorisée bras principale, et le contrôle de logiciels pour l&#39;acquisition automatique d&#39;images de plus longs intervalles de temps multiples avec z-piles. Le système doit reposer sur une table pneumatique à être isolé des vibrations. </li><li> Monter un incubateur étape-top pour maintenir les cellules à 37 ° C, 5-10% de CO 2 dans une chambre humidifiée. Prévoyez suffisamment de temps pour que le système atteindre une température stable pour minimiser les artéfacts de mouvement pendant l&#39;expérience. </li><li> Utiliser un collier chauffant pour objectif d&#39;empêcher le siphonnage objectif de la chaleur à partir de l&#39;échantillon. </li></ol> 3. Visualisation de l&#39;ADN marqué <ol><li> Cellules de la plaque de 35 mmverre à fond plat, à une densité de confluence moins de 10%, ce qui permettra aux paires de cellules à se diviser en colonies de 8-16 cellules sans chevauchement. Pour ce faire, au moins 24-48 heures avant l&#39;imagerie de telle sorte que les cellules viables ont le temps de se diviser. </li><li> Un à trois heures avant le début de la formation d&#39;image, la plaque de rinçage 3 fois avec du milieu de culture dépourvu de ces deux médicaments sélectifs et IPTG. Cette procédure nettoie les cellules non viables et permet Laci protéines de fusion pour lier les sites Laco dans les plasmides. </li><li> Remplacez le milieu de culture avec 2 ml de DMEM avec 10% de sérum de veau foetal et 25 mM d&#39;HEPES. </li><li> Remplacer la partie supérieure de la boîte de culture avec CultFoil étiré dans une bague de montage pour un plat de 35 mm. Cette couverture va inhiber l&#39;évaporation du milieu de culture, ce qui augmenterait la concentration de sel dans le temps et tuer les cellules. </li><li> Utiliser interférence contraste différentiel (DIC) d&#39;imagerie pour visualiser les cellules et déterminer le plan focal de la partie supérieure et inférieure des cellules dans plusieurs champs de vision.Dans chaque domaine, passer à un plan focal d&#39;environ 1/3 de la voie à partir du haut de la cellule. Enregistrer les coordonnées x, y, z dans la liste des postes de scène enregistrés. Remarque: Les signaux plasmides peut ne pas être visible à travers les oculaires lorsque les cellules sont éclairées par des LED de la longueur d&#39;onde appropriée pour la protéine de fusion LacI. Signaux faibles ne peuvent être visibles à l&#39;utilisation de l&#39;appareil photo EMCCD, ce qui permet l&#39;intégration du signal dans le temps et donc amplifie efficacement des signaux faibles. </li><li> Dans le logiciel de commande microscope, définir une z-pile d&#39;images devant être effectuées au niveau de chaque position de phase enregistrée. Choisissez la taille de l&#39;étape az 0,35 à 0.50 pm, ce qui vous permettra de Nyquist d&#39;échantillonnage approximative dans la dimension z 14. Inclure les &quot;extra&quot; tranches au-dessus et en dessous des plans dans lesquels se trouvent les cellules, ces tranches de permettre la détection suivre les mouvements cellulaires au cours du cycle cellulaire, et sont également utilisés dans le traitement post-acquisition (déconvolution) des piles d&#39;images. Cette inclusion seraentraîner une pile de 40-60 images, en fonction de l&#39;épaisseur des cellules. </li><li> Dans le logiciel de contrôle de microscope, de définir une expérience de séries chronologiques pour recueillir une image de champ lumineux de la z-piles à intervalles de 30 min (pour le suivi des divisions cellulaires et les migrations sur de longues périodes) et des images de fluorescence à 10-60 minutes d&#39;intervalle (pour visualiser des plasmides à l&#39;intérieur des cellules). Ne pas utiliser l&#39;imagerie DIC cours de l&#39;expérience, car elle nécessite plus de lumière que l&#39;imagerie standard du champ lumineux, ce qui peut exposer les cellules inutilement à la phototoxicité au cours de longues expériences. </li><li> Commencez l&#39;expérience contrôlée par logiciel. Assurez-vous que le système n&#39;est pas perturbé (frappée, exposé à la lumière ambiante excessive, etc) pendant l&#39;expérience. </li><li> Le cas échéant, remplacer l&#39;eau dans le système d&#39;humidification lors de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Post-traitement des images d&#39;acquisition <ol><li> Passez en revue les images pour chaque point z-pile et le temps. Rogner sur les zones inutiles d&#39;les images afin de réduire le temps de traitement de l&#39;ordinateur à l&#39;étape suivante. </li><li> Utiliser un algorithme de déconvolution pour ré-attribuer à l&#39;intensité du signal du pixel d&#39;origine de chaque pile 15-z. Bien que cette déconvolution peut être basée sur une fonction d&#39;étalement du point théorique de votre système d&#39;imagerie, il est préférable de mesurer la fonction d&#39;étalement de point de votre système d&#39;imagerie par microsphères fluorescentes, et d&#39;utiliser cette mesure dans l&#39;algorithme de déconvolution. Nous avons mesuré la fonction d&#39;étalement de point de notre système d&#39;imagerie et appliqué un. Limité algorithme itératif du maximum de vraisemblance dans AxioVision logiciel (description du logiciel AxioVision, Zeiss) </li><li> Examinez les images pour suivre les changements d&#39;intensité et les mouvements des plasmides cours du cycle cellulaire et la séparation des plasmides dans les cellules filles. </li></ol>

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	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode décrite ici peut être utilisé pour suivre en direct plasmides dans les cellules de mammifères au cours du temps couvrant plusieurs générations. En limitant l&#39;exposition à la lumière d&#39;excitation, nous avons utilisé ces techniques pour suivre les cellules de paires nouvellement divisées par des colonies de cellules 16-32, représentant au moins 72 heures et 3 divisions cellulaires. Ces expériences fournissent des informations qui ne peuvent être obtenues à partir d&#39;essais statiques te...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de streptomycine </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycine </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 pg / ml pour SLK, 300 pg / ml pour HeLa </td></tr><tr><td> Isopropyl-bD-galactoside (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Concentration finale de 200 pg / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> À fond de verre plats </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutre LED blanche </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Cube filtre 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif 63x/1.4 Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD caméra </td><td> Photométrie </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> TempControl mini- </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> TempControl 37-2 numérique </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI 3700 Contrôleur numérique </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif chauffe </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Étape de chauffage insert P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stage-dessus Incubateur S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Système humidificateur </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

Peu de plasmides d&#39;origine naturelle sont maintenus dans des cellules de mammifères. Parmi ceux-ci sont des génomes des herpèsvirus gamma, y compris les virus Epstein-Barr (EBV) et sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès (KSHV), qui provoquent de multiples tumeurs malignes humaines 1-3. Ces deux génomes sont répliquées de manière licence, chacun utilisant une seule protéine virale et de la machinerie de réplication cellulaire, et sont transmis aux cellules filles lors de la division cellulaire en dépit de leurs centromères traditionnels manquent 4-8. Beaucoup de travail a été fait pour caractériser les répliques de ces génomes plasmidiques en utilisant des méthodes telles que transfert de Southern et hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces méthodes sont limitées, cependant. PCR quantitative et transferts de Southern fournir des informations sur le nombre moyen de plasmides par cellule dans une population de cellules. FISH est un test unicellulaire qui révèle à la fois le nombre et la répartition moyenne de plasmide<html> s par cellule dans la population de cellules, mais est statique, ce qui permet pas d&#39;informations sur la société mère ou la descendance de la cellule examinée. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser plasmides dans des cellules vivantes. Cette méthode est basée sur la liaison d&#39;une protéine fluorescente marqués répresseur lactose à des sites multiples dans le plasmide d&#39;intérêt 9. L&#39;ADN d&#39;intérêt est conçu pour inclure environ 250 répétitions en tandem de l&#39;opérateur lactose (lacO) séquence. LacO est spécifiquement lié par la protéine répresseur lactose (LACI), qui peut être fusionnée à une protéine fluorescente. La protéine de fusion peut être exprimée à partir du plasmide génétiquement ou introduit par un vecteur rétroviral. De cette façon, les molécules d&#39;ADN sont marqués par fluorescence et deviennent donc visibles par microscopie à fluorescence. La protéine de fusion est bloquée de lier l&#39;ADN plasmidique par culture de cellules en présence d&#39;IPTG jusqu&#39;à ce que les plasmides sont prêtes à être visualisées. ontenu &quot;&gt; Ce système permet aux plasmides à surveiller dans les cellules vivantes à travers plusieurs générations, révélant les propriétés de leur synthèse et de partitionnement aux cellules filles. Idéal cellules sont adhérentes, facilement transfectées, et ont de gros noyaux. Cette technique a été utilisée pour déterminer que 84% de l&#39;EBV plasmides dérivés sont synthétisés chaque génération et 88% de la partition nouvellement synthétisé plasmides fidèlement aux cellules filles dans des cellules HeLa. Paires de ces plasmides EBV ont été vus pour être attachés ou associés à chromatides sœurs après leur synthèse dans S- phase jusqu&#39;à ce que ils ont été vus pour séparer les chromatides sœurs séparés dans Anaphase 10. La méthode est actuellement utilisée pour étudier la réplication des génomes KSHV dans des cellules HeLa et les cellules SLK. cellules HeLa sont immortalisés cellules épithéliales humaines, et les cellules sont immortalisées SLK endothéliales humaines cellules. Bien que les cellules SLK ont été à l&#39;origine dérivé d&#39;une lésion KSHV, ni la lignée cellulaire HeLa, ni SLK naturellement harbeurs génomes KSHV 11. En plus d&#39;étudier la réplication virale, cette technique de visualisation peut être utilisée pour étudier les effets de l&#39;ajout, la suppression ou la mutation des divers éléments de séquence d&#39;ADN sur la synthèse, la localisation et le partitionnement des autres recombinantes ADN plasmidiques.

<html> Les projections d&#39;intensité maximale de Z-piles acquises dans une expérience représentative sont présentés dans la figure 3. Typiques des signaux plasmide sont présents dans 3-8 tranches de la z-stack, selon qu&#39;ils représentent unique ou de groupes de plasmides. Dans le cas de l&#39;EBV et KSHV plasmides dérivés, les signaux se déplacent lentement à l&#39;intérieur de la cellule jusqu&#39;à ce que la pile atteint la mitose. Les cellules elles-mêmes migrent au cours de l&#39;e...

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Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Procédé d&#39;observation des molécules d&#39;ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d&#39;une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d&#39;ingénierie dans l&#39;ADN d&#39;intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vues.  University of Wisconsin - Madison. Procédé d'observation des molécules d'ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d'une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d'ingénierie dans l'ADN d'intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.

Vidéo: Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...