JMD et MKB sont financés par la science nanomédecine IGERT et technologie à la Northeastern University (financement du NCI et NSF Grant DGE-0504331). Ce travail a également été financée par les Instituts nationaux de la santé de l&#39;Institut national des sciences médicales générales R01 Grant GM084366. Nous remercions également Saumya Das et Anthony Rosenzweig du BIDMC à Boston pour fournir des myocytes cardiaques et Kevin Cash pour sa contribution à l&#39;élaboration du protocole d&#39;origine animale.

1. Préparation de optode Avant de faire l&#39;optode, des aliquotes des composants sont nécessaire afin qu&#39;ils puissent être facilement mesurés et enregistrés. <ol><li> A 50 mg de sodium ionophores X (Naix) et une fiole de 50 mg de sodium tétrakis [3,5-bis (trifluorométhyl) phényl] borate (NaTFPB) seront chacun grandi dans tetrahyrdofuran (THF) et répartie dans des tubes de 1,5 ml en polystyrène centrifugeuse. Dans une hotte, dissoudre 50 mg de Naix dans 1 ml de THF dans le flacon d&#39;expédition et mélanger afin de s&#39;assurer que le solide soit complètement dissoute. Transférer 100 ul de cette solution dans 10 tubes à centrifuger séparé. Répétez l&#39;opération pour NaTFPB. Laisser le THF à s&#39;évaporer dans une hotte nuit, l&#39;étiquette des tubes de centrifugation et de les placer dans un réfrigérateur de 4 degrés pour le stockage. Cela crée des aliquotes de 5 mg de sécheresse et de Naix NaTFPB. </li><li> Dissoudre le III Chromoionophore (CHIII) dans 1 ml de THF et le transfert d&#39;un flacon de 3 ml en verre. Ajouter un autre 1 ml de THF dans le flacon d&#39;expédition CHIII de dissoudre toute CHIII résiduelle et l&#39;ajouter à la fiole de verre 3 ml. Il y aura un total de 2 ml maintenant. Transférer 1 ml de la solution de THF CHIII dans deux fioles de verre séparées 1,5 ml avec une bouchons revêtus de Téflon. Conserver la solution dans un réfrigérateur CHIII 4 degrés à la concentration finale de 5 mg / ml. </li></ol> Ces aliquotes et solutions seront utilisées pour rendre le matériel optode. <ol start="3"><li> Pipeter 66 ul de bis (2-éthylhexyle) sébaçate (DOS) dans un flacon de 1,5 ml en verre avec un bouchon à vis en Teflon revêtement - c&#39;est le flacon optode. DOS est une solution visqueuse ainsi le soin doit être pris pour assurer la bonne quantité de solution est transféré dans le flacon. Le volume correspond à ~ 60 mg de MS-DOS. </li><li> Peser 30 mg de poly haute masse moléculaire (vinyle) de chlorure (PVC) et transférer les résultats vers le flacon optode. </li><li> Maintenant, ajoutez les composants fonctionnels aliquotés dans le flacon de optode pour créer l&#39;optode désiré. Les concentrations relatives des CHIII, Naix, et NaTFPB va déterminer la réponse du détecteur à sodium. Ces concentrations peuvent être ajustés pour avoir un capteur qui répond idéalement aux concentrations intracellulaires, avec un Kd de 10 mM, ou les concentrations extracellulaires, avec un Kd de 150 mm. En outre, il sera probablement à la variabilité de lot par lot des produits chimiques par le vendeur et l&#39;étalonnage des capteurs est nécessaire pour déterminer si la réponse correcte se produit pour chaque nouveau lot de composants chimiques. Nous décrivons ici la méthode pour créer un capteur avec des concentrations qui sont habituellement utilisés pour les mesures de sodium intracellulaire. </li><li> Dans une hotte, transférer 100 pl de la 5 mg / ml en solution CHIII THF pour le flacon optode. </li><li> Dissolvez 5 mg de Naix dans 300 ul de THF et de transfert 300 pl de la fiole optode, cette corrélation à 5 mg de Naix. </li><li> Dissoudre une aliquote de 5 mg de l&#39;NaTFPB dans 500 ul de THF et de transfert de 20 ul de la solution dans le flacon de optode, cette corrélation à 0,1 mg de NaTFPB. </li><li> Ajouter 80 ul de THF dans le flacon de optode. </li><li> La solution dans le flacon optode contient 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de Naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII dans 500 ul de THF. Vortexer doucement ce flacon jusqu&#39;à ce que tous le PVC a dissous. L&#39;optode doit être d&#39;une couleur rouge. Le montant total de THF ajouté au flacon doit être de 500 uL quel que soit le rapport des composants utilisés. </li><li> Laisser le THF restant dans le Naix et des aliquots NaTFPB de s&#39;évaporer durant la nuit et ré-étiqueter le tube avec la quantité correcte de produit chimique. </li></ol> 2. Créer nanocapteurs <ol><li> Pipeter 100 ul de 10 mg / ml de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - [méthoxy (polyéthylèneglycol) -550] dans le chloroforme (PEG-lipides) dans un flacon de 4 drams verre. Autoriser le chloroforme à s&#39;évaporer dans une hotte. Ce processus peut être accéléré par le séchage de la solution avec de l&#39;azote ou air de la maison. </li><li> Ajouter 4 ml de la solution aqueuse désirée dans le flacon avec PEG-lipides. Placez le flacon sur une prise de laboratoire au-dessous de la pointe sonication et augmenter le flacon jusqu&#39;à la pointe est d&#39;environ 7 mm de profondeur dans la solution et soniquer à une puissance faible sonication pendant 30 secondes. Ici, nous utilisons une Branson numériques sonificateur mis à l&#39;amplitude de 15% avec une pointe de ½ pouce de diamètre étape de corne. La solution aqueuse peut être une solution. Par exemple, pour déterminer la réponse des capteurs que nous utilisons l&#39;HEPES 10 mM pH 7,2 avec une base Trizma. </li><li> Alors que la solution est soniqué, mélanger 50 ul du matériel optode avec 50 ul de dichlorométhane dans un tube à centrifuger de 0,6 ml. Mélanger avec la pipette pour assurer un mélange uniforme. </li><li> Réglez la commande sonificateur à une sonication pendant 3 minutes. Démarrez le sonication et tout sonication ajouter la solution de mélange optode dans le flacon en plongeant la pointe de la pipette dans la solution et de distribuer les 100 ul de solution dans un rapide, même l&#39;injection. La solution doit virer au bleu, depending sur la solution aqueuse utilisée. </li><li> Autoriser la sonication se poursuivre pendant environ 30 secondes, puis baisser le cric pour que la pointe sonication est d&#39;environ 2 mm de profondeur dans la solution. Cela devrait commencer à aérer la solution et la solution devient opaque. Cette étape permet d&#39;enlever le THF résiduel et de la solution de dichlorométhane. </li><li> Une fois la sonication est terminée, tirez sur la solution de nanocapteurs dans une seringue de 5 ml. Fixer un filtre de 0,2 um seringue et passer la solution nanocapteur dans un flacon en verre avec bouchon à vis. La solution doit être limpide et bleu si une solution aqueuse qui contient moins de 10 mM de sodium et a un pH inférieur à environ 9 est utilisé. Sinon, il ne devrait pas avoir de couleur ou d&#39;être rose. </li></ol> 3. Déterminer la réponse nanonsensor Cette méthode est utilisée pour déterminer la réponse de nanocapteurs conçu pour mesurer sodium intracellulaire. Différentes concentrations sont recommandés pour être utilisés pour extracellulaire nanocapteurs concentration en sodium. <ol><li> Faire des solutions stock de 10 mM HEPES (0 Na) et de chlorure de sodium 1M (NaCl) dans 10 mM HEPES (1 M Na) et le pH de chacune de ces solutions à 7,2 en utilisant la base Trizma. Mélanger les solutions stock de 0 et 1 M Na Na dans 50 ml tubes à centrifuger coniques pour créer des solutions avec: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mm concentrations de NaCl. </li><li> Utilisez un fond optique plaque de 96 puits pour déterminer la réponse. Ajouter 100 ul de chaque concentration de sodium dans 3 puits d&#39;une colonne. Ceci va produire un tableau de 3 x 10 puits. </li><li> Pour chaque puits ajouter 100 ul de nanocapteurs fraîchement préparés et la charger dans un fluorimètre microplaque. Nous utilisons une Molecular Devices Spectramax M3. </li><li> Lisez chaque bien avec les longueurs d&#39;onde suivantes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Excitation (nm) </td><td> Emission (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> L&#39;intensité de nanocapteurs à chaque longueur d&#39;onde dépend de la concentration en sodium. L&#39;utilisation de la longueur d&#39;onde dépend des applications. Pour intracellulaire des mesures dynamiques lentes, nous utilisons 488 nm/570 nm (excitation / émission) et 488 nm/670 nm qui nous permettent de ratio de deux longueurs d&#39;onde et de réduire le bruit. <ol start="5"><li> Traditionnellement, optode données sont converties en une des valeurs qui sont: α = (I - I min) / (I max - I min), où I est l&#39;intensité à une concentration de sodium donné, je min est la plus faible intensité dans les mesures de réponse , et I max est la plus grande intensité dans les mesures de réponse. Convertir soit le ratio d&#39;intensité à 570 nm divisée par l&#39;intensité à 670 nm ou de l&#39;intensité à 680 nm à α. </li><li> Utilisez un logiciel de traçage, Excel ou Origin sont généralement utilisés dans notre laboratoire, pour tracer α en fonction du log de la concentration de sodium, la mise dans le journal de la concentration de sodium de zéro à -1. Ajuster une courbe sigmoïde à la réponse. D&#39;après la courbe, calculer la concentration de sodium à α = 0,5, qui représente la concentration à laquelle le capteur répond de façon optimale. </li><li> Ajustez le taux d&#39;CHIII, Naix, et NaTFPB dans le optode de créer nanocapteurs avec une réponse optimale autour de la concentration en sodium de l&#39;intérêt. </li></ol> 4. Imagerie intracellulaire <ol><li> Pour des mesures intracellulaire, les nanocapteurs sont faites en 5 mg / ml de glucose dans l&#39;eau et micro-injectées dans les cellules. </li><li> Croître ou le transfert de cellules dans un plat à fond de verre ou dans une chambre d&#39;imagerie avec un fond lamelle de verre. </li><li> Incuber les cellules dans les médias claire ou une solution de Tyrode. Montez la chambre de l&#39;imagerie ou un plat sur un microscope à épifluorescence. Nous utilisons un Zeiss LSM 7 microscope confocal. </li><li> Tirez capillaire en verre avec un extracteur de pipette. Nous utilisons une Sutter flamboyante brune p-97 avec 1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm ID de verre, d&#39;un diamètre de l&#39;extrémité finale autour 300-500 nm. </li><li> Remblai de la pipette avec la solution de nanocapteurs utilisant une seringue et une aiguille Hamilton, ou un chargeur de micropointes et une pipette. </li><li> Montez la pipette dans un support qui est attaché à un micromanipulateur et relié à un système d&#39;injection à pression contrôlée. Ici, nous utilisons un micromanipulateur Burleigh EXFO 6000 PCS et une société médicale des systèmes d&#39;injection. </li><li> Basse de la pipette sur le dessus de la cellule et dans le cytoplasme, il est parfois nécessaire de &quot;taper&quot; le titulaire manipulateur pour percer la membrane. Injecter la solution nanocapteurs et retirer rapidement la pipette. </li></ol> 5. Imagerie in vivo Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par Animal Care Northeastern University et le Comité d&#39;utilisation. <ol><li> Nanocapteurspour les in vivo, imagerie extracellulaire sont faites dans du tampon phosphate salin et ajusté pour avoir une réponse optimale à sodium à une concentration de sodium de 135 mm. </li><li> Pour l&#39;injection d&#39;installation et d&#39;imagerie de l&#39;nanocapteurs fluorescents chez la souris, nous utilisons le IVIS Lumina II et son unité d&#39;anesthésie sont associés. Désinfecter l&#39;induction et chambres d&#39;imagerie. Placez la souris nude CD1 (environ 20g) dans la chambre de l&#39;induction et les exposent à l&#39;isoflurane. Le pour cent du débit d&#39;oxygène administré isoflurane et varient selon l&#39;espèce et le poids des souris. Attendez la souris pour devenir pleinement anesthésiés. </li><li> Après les souris sont anesthésiées, retirer les souris de la chambre de l&#39;induction et le placer dans la chambre de l&#39;imagerie. Gardez la souris sous anesthésie. Pour chaque souris, désinfecter les zones d&#39;injection désiré. </li><li> Remplir une seringue d&#39;insuline stériles 31G avec 10 uL de nanocapteurs en veillant à éliminer toutes les bulles d&#39;air. </li><li> En utilisant une pince, saisir un petit pli de la peau le long du dos de la souris sur le site d&#39;injection désiré. Tout en saisissant la peau, insérer la seringue dans la peau avec le biseau vers le haut et le parallèle l&#39;aiguille à la peau. </li><li> Avant d&#39;injecter les capteurs, tirez sur le piston de la seringue pour s&#39;assurer que l&#39;aiguille n&#39;est pas insérée dans un vaisseau sanguin. Puis, déplacez doucement le droit d&#39;aiguilles et de gauche pour créer une poche dans la peau. Cela permettrait de minimiser la contre-pression qui provoque les capteurs de s&#39;échapper du site d&#39;injection. Injecter des capteurs et retirez délicatement la seringue. </li><li> Appuyez doucement sur le site d&#39;injection et essuyez toute solution qui peut avoir fui hors du site d&#39;injection. Cela permettrait de minimiser la fluorescence de capteurs qui ne sont pas injectés dans la peau. </li><li> Répétez les étapes 5.4 à 5.7 jusqu&#39;à ce que le nombre de zones d&#39;injection souhaitée est atteinte. Six sites d&#39;injection espacés sur le côté gauche et à droite de l&#39;arrière sont recommandés. Pour chaque souris individuelle, le changement d&#39;aiguilles, si l&#39;aiguille devient difficile d&#39;insérer dans la peau. Aiguilles ne doivent pas être partagés entre les souris. Cela permettrait de minimiser la transmission de maladies ou de contamination croisée entre les souris. </li><li> Pour les capteurs d&#39;imagerie fluorescente de sodium, on acquiert à la fois clair et des images fluorescentes de la souris en utilisant des jeux de filtres que la plupart correspondait étroitement à la nm/680 640 nm (excitation / émission) spectre de la nanocapteurs et que aussi minimiser l&#39;autofluorescence de la peau. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Courbes de réponse de cinq différents ensembles nanocapteur au sodium. Chaque ensemble représente nanocapteurs à partir des formulations différentes optode qui avait la même quantité de CHIII, NaTFPB, PVC et DOS, mais des quantités variables de Naix. Les données ont été converties en valeurs α en utilisant les intensités 639/680 nm. Les données sont une moyenne de 3 barres d&#39;erreur, omis pour la clarté, avec une courbe sigmoïde équipé utilisant origine. Dans cette courbe de réponse, la concentration maximale de sodium utilisé était de 500 mM. Le Kd de l&#39;nanocapteurs de sodium de sodium varie de 10 mM (diamants orange) à environ 150 mm (carrés noirs). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Injecté myocytes cardiaques néonatales. Les cellules ont été cultivées sur lamelle, monté sur un microscope et injectée avec nanocapteurs de sodium. Illustré sont fluorescents (excitation 639 nm), clair, et la superposition. Notez que certains de clustering sonde se produit, mais les cellules ont une morphologie normale, les capteurs ont diffusé dans le cytosol et il n&#39;ya pas de chargement nucléaire. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Injection sous-cutanée de souris avec nanocapteurs de sodium. Neuf injections différentes de nanocapteurs de sodium ont été faites dans l&#39;espace sous-cutanée de souris nude. Les deux champs lumineux et images fluorescentes (640/680) sont superposées.

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La formation de nanocapteurs devraient pas prendre plus de 10 minutes une fois la solution optode a été faite et le lipide PEG séché. Optode ne peut pas seulement être prises rapidement en cas de besoin, mais lorsqu&#39;il est conservé à 4 degrés Celsius, ils peuvent être stables pendant des mois. Nous avons montré que l&#39;nansensors, une fois formés, sont stables en solution pendant au moins une semaine;. Cependant, des précautions doivent être prises pour empêcher photoblanchiment cours de cette période en bloquant les nanocapteurs de la lumière 6 Bien nanocapteurs de sodium ont été démontré ici, optodes ont été créés pour la plupart des ions biologiquement pertinents tels que le potassium et le chlorure. 10,12 Nous avons également étendu cette technologie à de petites molécules comme le glucose. 13 En plus de générer nanocapteurs pour surveiller différents analytes, ces nanocapteurs se prêtent à d&#39;autres changements qui les rendent utiles dans la plupart des expériences biologiques. Par exemple, le revêtement de surface, dans ce cas, le poly (éthylène glycol), peut facilement être changé en utilisant toute molécule amphiphile qui est soluble dans l&#39;eau. Cela permet la possibilité de fonctionnalisation de ces nanoparticules pour des applications différentes ou des cibles. La taille des nanoparticules peut également être ajustée en changeant le revêtement de surface, l&#39;intensité sonication ou le solvant utilisé. Indicateurs de calcium fluorescents ont été précieux dans la détermination de la signalisation intracellulaire de calcium, mais pas de colorants de sodium disponibles sensibles ont les mêmes caractéristiques idéales. Optode nanoparticules pour but de fournir une méthode alternative pour les ions d&#39;imagerie intracellulaire ont été en développement pendant des années 14. Nous avons construit sur ​​cette recherche précédentes pour créer nanocapteurs spécifiques pour l&#39;imagerie de sodium intracellulaire qui devrait permettre de fournir un moyen de comprendre comment la signalisation de sodium affecte la fonction cellulaire et altérations de la signalisation qui conduisent à certaines maladies. L&#39;utilisation de nanocapteurs fluorescents in vivo en temps réel offre une-alternative minimalement invasive pour les analytes de surveillance sur les autres méthodes telles que le sang attire 3. Sodium et de glucose nanocapteurs basé sur la technologie ci-dessus a été démontré que de suivre l&#39;évolution de sodium et de glucose, respectivement en vivo. 3,13 Toutefois, il existe actuellement des limites à cette méthode comme un outil de surveillance. Par exemple, les capteurs doivent contenir un fluorophore avec un éventail suffisamment décalée vers le rouge proche infrarouge afin de minimiser l&#39;autofluorescence de fond de la peau. 15 Deuxièmement, la technique d&#39;injection de courant ne produit pas d&#39;injection uniforme des nanocapteurs qui pourraient être causés par de telles erreurs que les variations de la profondeur d&#39;injection. Malgré ces limites, le développement de ces nanocapteurs fluorescents et leur démonstration réussie pourrait rendre ces capteurs un outil de recherche inestimable et méthode de surveillance de la santé des patients.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du produit </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> IVIS Lumina Package II est un instrument </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 chez la souris nude </td><td> Charles River </td><td> Code de souche: 086 </td><td> Immunodéficientes </td></tr><tr><td> Seringues à insuline </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc ml, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Très haut poids moléculaire en PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naix </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mince paroi de verre capillaires </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lipides PEG </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Fournit une liste de produits chimiques et les équipements utilisés dans cette procédure. Tous les produits chimiques courants ne figurent pas été achetés chez Sigma.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Homéostasie ionique strictement réglementé dans tout le corps est nécessaire pour la prévention de ces états débilitants comme la déshydratation. 1 En revanche, les flux ioniques rapides au niveau cellulaire sont nécessaires pour initier des potentiels d&#39;action dans les cellules excitables. 2 du règlement de sodium joue un rôle important dans les deux ces cas, cependant, il n&#39;existe aucune méthode actuellement de surveiller en permanence les niveaux de sodium in vivo 3 et 4 sondes de sodium intracellulaire ne fournissent pas de semblables résultats détaillés comme sondes calciques. Dans un effort pour combler ces deux lacunes, des nanocapteurs fluorescents ont été développés qui peuvent surveiller les concentrations de sodium in vitro et in vivo. 5,6 Ces capteurs sont basés sur la technologie optode sélective d&#39;ions et se composent de particules de polymère plastifié reconnaissance de sodium dans lequel spécifiques éléments, sensibles au pH fluorophores, et des additifs sont intégrés. 7-9 mécaniste, l&#39;élément de reconnaissance de sodium extraits de sodium dans le capteur 10. Cette extraction entraîne le fluorophore sensible au pH de libérer un ion hydrogène pour maintenir la neutralité de charge dans le capteur qui provoque un changement de fluorescence. Les capteurs de sodium sont réversibles et sélectifs pour le sodium plus de potassium, même à fortes concentrations intracellulaires. 6 Ils sont environ 120 nm de diamètre et sont revêtues de polyéthylène glycol à transmettre biocompatibilité. En utilisant des techniques de micro-injection, les capteurs peuvent être livrés dans le cytoplasme des cellules où elles ont été montrées pour surveiller la dynamique spatiale et temporelle de sodium de battre les myocytes cardiaques. 11 En outre, ils ont également suivi en temps réel l&#39;évolution des concentrations de sodium in vivo lorsqu&#39;elle est injectée sous-cutanée dans des souris 3 de la présente, nous expliquons en détail et de démontrer la méthodologie utilisée pour la fabrication de nanocapteurs fluorescents de sodium et brièvement démontrer les applications biologiques de notre laboratoire utilise les nanocapteurs pour:. la micro-injection des capteurs dans les cellules, et l&#39;injection sous-cutanée des capteurs dans des souris .

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanoparticules fluorescentes fabriqués dans notre laboratoire sont utilisés pour des concentrations d&#39;ions d&#39;imagerie et de flux d&#39;ions dans les systèmes biologiques tels que les cellules au cours du liquide interstitiel lors de signalisation et de l&#39;homéostasie physiologique.

Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d&#39;ions dans les systèmes biologiques

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.2K vues.  Northeastern University. Nanoparticules fluorescentes fabriqués dans notre laboratoire sont utilisés pour des concentrations d'ions d'imagerie et de flux d'ions dans les systèmes biologiques tels que les cellules au cours du liquide interstitiel lors de signalisation et de l'homéostasie physiologique.

Vidéo: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Méthodologie élastographie par résonance magnétique pour l&#39;évaluation des tissus Conçu croissance Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Recherche

Bio-ingénierie

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Étude Soft-matière et les systèmes biologiques sur une échelle de longueur large de nanomètre et micromètre Tailles au Petit-angle Neutron Diffractomètre KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Fusion Ion Concentration Polarisation entre juxtaposées échangeuses d&#39;ions Membranes pour bloquer la propagation de la Zone Polarisation

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Échographie Doppler transcrânienne fonctionnelle pour la surveillance du flux sanguin cérébral

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...