This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

1. Réglage de la triaxial Bobines REMARQUE: La figure 1 montre les bobines triaxiales utilisés pour inverser la GMF. <ol><li> Allumer le magnétomètre à trois axes, dont la sonde est insérée dans les bobines triaxiales. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur et lancez le logiciel de magnétomètre qui permet aux données d&#39;être collectées à partir magnétomètre trois axes. </li><li> Utilisez les valeurs des composants rapportés par le magnétomètre pour calculer l&#39;ampleur de la GMF. Par exemple, avec des valeurs de magnétomètres: Bx = 6.39 uT, Par = 36.08 uT, Bz = 20.40 uT calculer une intensité de champ de 41.94 uT en utilisant l&#39;équation suivante: B = B GMF + B supplémentaires, où B supplémentaire = (Bx 2 + Par Bz 2 + 2) ½ (à savoir, 41,9 uT dans l&#39;exemple). </li><li> Allumez les trois alimentations en courant continu (double gamme: 0-8V / 0-20V 5A et / 2.5A, 50W) chacun relié à trois couples des bobines de Helmholtz et connecté à un ordinateur via une connexion GPIB (figure 1B). </li><li> Set tensions des alimentations pour générer le champ magnétique désiré avec un vecteur de champ magnétique inversé. Par exemple, avec B GMF comme dans l&#39;étape 1.3 et avec la taille de la bobine de l&#39;instrumentation décrit ici, régler les tensions V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0.00 V afin de générer une nouvelle résultante B = B + B GMF bobines triaxiaux = (6,38, -36,08, 20.39) uT. ie, un nouveau domaine avec le même ordre de grandeur que B GMF mais pointant vers une direction différente. </li><li> Vérifiez le nouveau domaine avec le logiciel de magnétomètre en utilisant la procédure décrite au point 1.3. </li><li> Exposer les plantes à la fois normal et inversé conditions FMV en utilisant des boîtes de Pétri comme décrit dans la section 2. </li><li> Effectuer des expériences d&#39;exposition fictive en gardant l&#39;amplitude du champ égale à | B GMF | et la tenuela composante verticale du champ égale à celle de la GMF mais la modification de la direction (à savoir, &quot;Nord, Est ou Ouest&quot;) de la composante horizontale du champ par des courants égaux dans les enroulements à trois axes par rapport à l&#39;état d&#39;inversion de champ. Pour ce faire, par modification de la tension des bobines comme décrit dans 1.5. Remarque: Cette exposition fictive exclut chauffage subtile potentiel ou les effets de vibration provenant soit les bobines elles-mêmes ou de l&#39;électronique utilisés pour contrôler les bobines. </li><li> Exécutez expériences en double aveugle en appliquant des conditions de terrain aveuglés de personnel réalisant le reste des expériences et / ou l&#39;interprétation des données. </li></ol> 2. Préparation des matériaux et des conditions de croissance Plant <ol><li> Utiliser des semences d&#39;Arabidopsis thaliana, écotype Columbia 0 (Col 0), placer ensuite dans un tube de 1,5 ml et surface stériliser par traitement avec une 5% (p / v) de solution d&#39;hypochlorite de calcium et 0,02% (v / v) de Triton X-100 dans 80% d&#39;éthanol (EtOH), pour 10 à 12 min à 25-28 ° C, sous agitation continue. Puis rincer deux fois avec 80% EtOH, laver avec de l&#39;EtOH à 100% et enfin rincer à l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Préparer 1 litre de 22 Murashige et Skoog (MS) modifié par adjonction moyen: 2,297 g de MS (MS 0,5 x Basal Mélange de sel), 10 g de saccharose, de l&#39;eau désionisée jusqu&#39;à 1 L, pH ajusté de 5,8 à 6,0 avec KOH. Ajouter 16 g d&#39;agar et autoclave pendant 20 min, 120 ° C. </li><li> Avant la solidification, versez 80 ml ​​de milieu dans chaque (120 x 120 mm 2) boîtes de Pétri carrés. Semez trente semences stériles sur la plaque, puis sceller les plaques avec un film cireux. </li><li> Vernalize les plaques horizontalement dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 2 jours pour potentialiser et de synchroniser la germination, puis exposer boîtes de Pétri soit normale ou inversée GMF. </li><li> Exposer les graines dans un environnement contrôlé de température à 22 ° C en position verticale dans des expériences parallèles à la fois à l&#39;intérieur des bobines triaxiales et à l&#39;extérieur des bobines triaxialesen vertu d&#39;un calendrier de photopériode de 8 h obscurité et 16 heures de lumière, en utilisant des lampes à vapeur de sodium (220 x 10 -6 m E -2 s -1). Utilisez un film de gélatine bleue pour projecteur pour réduire la composante rouge de lampes. </li><li> Exposer les plantes pendant 10 jours avant l&#39;extraction de l&#39;ARN à la fois normale (contrôle) et l&#39;inversion (de traitement) du FMV. </li><li> Après l&#39;exposition, prendre des photos des boîtes de Pétri. </li><li> Utilisez le logiciel ImageJ pour calculer les zones de la longueur des racines et des feuilles. <ol><li> Brièvement, mesurer le côté de la boîte de Pétri, puis ouvrez l&#39;image de la boîte de Pétri et en utilisant l&#39;option de ligne &quot;droite&quot; pour dessiner une ligne qui traverse exactement le côté de la plaque. </li><li> Dans le menu «analyser», sélectionnez «barème fixé&quot; et insérez la distance réelle dans la boîte &quot;de distance connue&quot; (par exemple, 120 mm), puis insérez l&#39;unité de longueur (mm); enfin cliquez sur l&#39;option &quot;global&quot; pour effectuer les réglages disponibles pour toutes les mesures. </li><li> Pour Root longueur, suivre attentivement la forme de la racine à l&#39;aide de l&#39;outil à main levée. Mesurer la longueur à l&#39;aide de l&#39;option &quot;mesure&quot; dans le menu &quot;analyser&quot;. Continuer à mesurer toutes les racines dans l&#39;image et enregistrez le fichier pour d&#39;autres analyses statistiques. </li><li> Pour la surface foliaire, dans le menu &quot;image&quot; utiliser l&#39;option, puis &quot;seuil de couleur&quot; régler. Sélectionnez la feuille individuelle et dans le menu «analyser», sélectionnez «analyser des particules&quot;. Sauvegardez les mesures individuelles pour des analyses statistiques. </li></ol></li></ol> 3. Arabidopsis Extraction des ARN totaux, quantitative PCR en temps réel (qPCR) Conditions de réaction et d&#39;amorces pour Arabidopsis <ol><li> Recueillir séparément 30 et 30 pousses racines et geler immédiatement dans de l&#39;azote liquide. Ensuite moudre dans l&#39;azote liquide avec un mortier et un pilon. </li><li> Isoler l&#39;ARN total en utilisant un kit de purification et de RNase-Free kit de traitement de DNase en utilisant manufacturles instructions du RE. </li><li> Vérifier la qualité et la quantité de l&#39;échantillon en utilisant un kit d&#39;électrophorèse de l&#39;ARN et de nano gel capillaire selon les instructions du fabricant. Confirmer la quantification de l&#39;ARN par spectrophotométrie. </li><li> Utiliser 2 ug d&#39;ARN total et des amorces aléatoires en utilisant un kit d&#39;ADNc transcription inverse pour obtenir des ADNc de premier brin selon les recommandations du fabricant. </li><li> Effectuer toutes les expériences sur un système en temps réel en utilisant SYBR Green I avec ROX comme une norme de chargement interne. </li><li> Effectuer la réaction avec 25 pi de mélange constitué de 12,5 ul de 2x SYBR Green QPCR Master Mix, 0,5 pi de l&#39;ADNc et 100 amorces nm. Utilisez les amorces énumérées dans le tableau 1. Inclure dans les contrôles des contrôles non-RT (en utilisant l&#39;ARN total sans transcription inverse pour surveiller la contamination d&#39;ADN génomique) et des contrôles non-modèle (eau au lieu de modèle). </li><li> Calculer l&#39;efficacité primaire pour toutes les paires d&#39;amorces utilisant la normeméthode de la courbe 23. </li><li> Utiliser les conditions de PCR suivantes: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min à 95 ° C, 40 cycles de 15 s à 95 ° C, 30 secondes à 58 ° C, et de 30 sec à 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, RETOUR1, GAPC2, CAT3, tapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min à 95 ° C, 40 cycles de 15 s à 95 ° C, 20 sec à 57 ° C, et de 30 sec à 72 ° C. </li><li> Lire la fluorescence après chaque phase de recuit et l&#39;extension. Pour tous les essais, effectuer une analyse de courbe de fusion de 55 à 95 ° C en incluant le segment de dissociation dans le profil thermique. Utilisez l&#39;écran de la courbe de dissociation, accessible via l&#39;onglet Résultats pour voir le profil de dissociation (de la parcelle de la fluorescence en fonction de la température). Assurez-vous que l&#39;ensemble des données recueillies au cours du segment de dissociation de l&#39;expérience est sélectionné pour l&#39;analyse en utilisant l&#39;écran Analyse / Setup. </li><li> Déterminer la lEcouteur gamme de concentration de matrice de valeur de cycle seuil (valeur de Ct) en effectuant une série de dilutions par dix (de 1 à 10 3 -fois) en utilisant un ADNc à partir de trois extractions d&#39;ARN indépendantes analysées dans trois répétitions techniques 24,25. </li><li> Analyser toutes les parcelles d&#39;amplification avec le logiciel de l&#39;instrument de PCR en temps réel pour obtenir des valeurs de Ct. Calibrer et normaliser les niveaux d&#39;ARN rapport avec le niveau des meilleurs gènes de ménage comme suit: 3.11.1) Accéder au Amplification écran Parcelles via l&#39;onglet Résultats, sélectionnez la rampe ou plateau pour lesquels les données doivent être analysées à l&#39;aide de l&#39;écran / Setup Sélection Analyse, puis sélectionnez la DRN (fluorescence normalisée de référence corrigée) dans le menu de fluorescence sur le panneau de commande. Accéder à la plaque écran exemples de valeurs à travers l&#39;onglet Résultats pour afficher les valeurs de Ct pour les puits échantillonnés. </li><li> Utiliser quatre gènes de référence différentes [par exemple, cytoplasmique de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, (GAPC2), l&#39;ubiquitine spécific protease 6 (UBP6), actine-1 (ACT1) et le facteur d&#39;élongation sous-unité alpha 1B 2 (eEF1Balpha2)] pour normaliser les résultats de la PCR en temps réel. Sélectionnez le premier rang génique utilisant un logiciel d&#39;analyse 26; et d&#39;utiliser le gène le plus stable pour la normalisation. <ol><li> En bref, organiser les données d&#39;entrée sur une feuille Excel avec la première colonne contenant les noms de gènes et la première ligne contenant les noms des échantillons. Ensuite, sélectionnez le logiciel d&#39;analyse de la barre de menu. Utilisez la boîte de dialogue pour sélectionner les données d&#39;entrée. </li><li> Ensuite, vérifiez les champs les noms d&#39;échantillons, les noms de gènes et simple sortie seulement. Cliquez sur le bouton Go pour effectuer l&#39;analyse. Sélectionnez le haut gène classé (qui a la valeur de stabilité plus petit) comme gène candidat le plus exprimé de façon stable. </li></ol></li><li> Données de parcelle par montrant le changement expression pli différentiel dans les deux pousses et des racines. </li></ol> 4. Analyses statistiques <ol><li> Exprimez données en tant que valeurs moyennes ± erreur standard. Comparez le control et les groupes de traitement en effectuant une analyse de variance (Anova) et le test de Tukey avec Bonferroni et Dunn-Sidak test de probabilité ajusté (0,95% de confiance). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nous avons récemment montré qu&#39;une étonnante corrélation existe entre les inversions de FMV et le moment où le détournement de la plupart des lignées familiales Angiospermes survenu 2. Cependant, malgré les hypothèses stimulantes et la pléthore d&#39;études sur l&#39;effet des intensités variées FMV, l&#39;hypothèse que le FMV inversion peut se induire des changements importants dans l&#39;expression des gènes de la plante et de la morphologie n&#39;a jamais été démontrée. Ici, nous montrons pour la première fois, un procédé qui utilise une bobine de Helmholtz octogonal triaxial pour inverser GMF dans notre laboratoire, et que l&#39;inversion du champ magnétique ambiant peut provoquer des changements phénotypiques et modulation de l&#39;expression génique dans les plantes. Afin d&#39;obtenir l&#39;inversion GMF (ou modification) sur un volume suffisant pour les expériences de la croissance des plantes (2 x 2 x 2 m 3), nous avons construit un système octogonale de bobines de Helmholtz. Ce système ne sont pas disponibles dans le commerce (bobines de Helmholtz sont généralement en forme d&#39;anneau et plus petit)et les coûts de construction ont été considérables. Surtout, ce système offre une modification du champ robuste, avec des temps exceptionnelle stabilité et l&#39;homogénéité dans les champs magnétiques modifiés. Le système est conçu et construit pour réduire la valeur de la GMF à un millième des conditions normales ou de renverser l&#39;un des trois dimensions du champ magnétique. Cependant, la conception des bobines ne permet pas de générer une intensité de champ magnétique élevé. Par conséquent, cet instrument dans sa forme actuelle ne convient pas pour des expériences visant à évaluer l&#39;effet de la force du champ magnétique élevé sur les plantes ou d&#39;autres organismes. En laboratoire, l&#39;altération de la GMF similaires à ceux décrits dans ce procédé a été obtenu par différentes méthodes, y compris le blindage en entourant la zone expérimentale par des plaques métalliques ferromagnétiques à perméabilité magnétique élevée, qui diffèrent des champs magnétiques et les concentrer au sein du métal lui-même. The avantage d&#39;utiliser des bobines de Helmholtz est que le système permet aux plantes d&#39;être exposés à des conditions plus naturelles (lumière, circulation d&#39;air, etc.), ce qui le rend idéal non seulement pour les études in vitro (comme avec l&#39;utilisation de boîtes de Pétri) mais aussi pour vivo la croissance de la plante et des expériences de développement. Les dimensions de notre système de créer un espace qui permet une suppression à &lt;1 / 1000e du GMF naturelle tout au long d&#39;un 25 x 25 x 25 cm 3 volume sphérique (voir la figure 1A), permettant ainsi d&#39;accueillir plusieurs boîtes de Pétri ou certains petits pots pour la croissance des plantes. La méthode présentée ici a été appliquée à des études de biologie végétale; Cependant, le système permet un large éventail d&#39;expérimentation, y compris la virologie et de microbiologie, ainsi que des études sur les nématodes (par exemple, Caenorhabditis elegans), les arthropodes et les petits animaux (y compris les souris et les rats). Par conséquent, les tests de l&#39;hypothèse que l&#39;inversion de la GMF est capablepour induire des changements morphologiques et de transcription pourraient également être étendus à de nombreux autres systèmes de vie, peut-être en fin de compte, même pour les cellules humaines. Le FMV est en constante évolution et fluctuante. Par conséquent, dans nos expériences un défi majeur est de fournir une compensation constante de la GMF pour obtenir les nouvelles valeurs souhaitées FMV. Cela ne peut être réalisé par un contrôle continu des valeurs de champs magnétiques à travers la lecture des valeurs de magnétomètres et compensation de tension. Par conséquent, le système peut compenser la partie variant lentement de la GMF, mais il ne fait rien pour les plus élevés fluctuations de fréquence. En conclusion, l&#39;utilisation de bobines triaxial pour inverser le vecteur FMV a contribué à démontrer que ce renversement du vecteur GMF est capable d&#39;induire des changements morphologiques végétales et l&#39;expression différentielle des gènes. Les résultats obtenus avec la méthode présentée fournissent une preuve convaincante à l&#39;appui de l&#39;hypothèse que la re GMFlettrines pourraient avoir été l&#39;une des forces motrices de l&#39;évolution des plantes sur des périodes géologiques 2.

Le champ magnétique de la Terre (ou de manière équivalente le champ géomagnétique, GMF) est un facteur environnemental incontournable pour tous les organismes vivants sur la planète, y compris les plantes. La GMF a toujours été une caractéristique naturelle de la Terre, afin cours de l&#39;évolution, tous les organismes vivants connu son action. Un nombre croissant de preuves montre que le GMF est capable d&#39;influencer de nombreux processus biologiques 1. Le FMV est pas uniforme et il ya d&#39;importantes différences locales dans son ampleur et la direction de la surface de la Terre. Le GMF à la surface de la Terre présente une large gamme de grandeurs, allant de moins de 30 uT à près de 70 uT. Le GMF protège la Terre et sa biosphère des effets létaux de vent solaire en déviant la plupart de ses particules chargées à travers la magnétosphère 2. Les plantes répondent à des stimuli environnementaux; et les réponses classiques aux facteurs abiotiques tels que la lumière et la gravité ont été thoroughly décrit en définissant les réponses dites phototropes et gravitropique. Très peu, ou rien, qui est connu sur les mécanismes de perception et de réponses des plantes à des champs magnétiques, malgré la pléthore d&#39;articles publiés sur ce sujet et a récemment examiné 1. Contrairement au champ gravitationnel, la GMF a changé régulièrement au cours de l&#39;évolution des plantes représentant ainsi une importante abiotique facteur de stress qui a été récemment considéré comme une force motrice potentielle éventuellement contribuer à planter diversification et spéciation 2. Inversions géomagnétiques (ou excursions) sont changements de polarité de la GMF. Pendant la vie histoire de la Terre, des inversions FMV ont eu lieu à plusieurs reprises. Ces exposés de la planète à des périodes de force GMF réduite pendant chaque transition de polarité. Certains auteurs ont émis l&#39;hypothèse que ces transitions périodes de faible intensité pourraient GMF ont permis rayonnements ionisants du vent solaire d&#39;atteindre la surface de la Terre, induisant ainsi unele stress cohérente pour les organismes vivants, qui aurait pu être assez forte pour induire des altérations génétiques conduisant finalement à planter évolution 2. Une analyse détaillée des expériences décrivant les effets des champs magnétiques sur les plantes montre un grand nombre de rapports contradictoires, caractérisé par un manque de mécanismes d&#39;interaction biophysique plausible. De nombreuses expériences sont tout simplement irréaliste, tandis que d&#39;autres manquent d&#39;une hypothèse vérifiable et, finalement, ne sont pas convaincantes 3. Au cours des dernières années, l&#39;état d&#39;avancement de la recherche sur les effets des champs magnétiques sur végétales a été étudié 2,4-11. Récemment, l&#39;effet de champ magnétique à la fois basse et haute a été discuté à fond 1, avec un accent particulier sur la participation des événements d&#39;inversion du FMV sur l&#39;évolution de l&#39;usine 2. Les moyens les plus directs pour justifier l&#39;hypothèse que les inversions du FMV affectent l&#39;évolution des plantes est de synthétiser un GMFinversion du laboratoire en testant la réponse des plantes à des conditions de champ magnétique normale et inversée. Pour tester cette hypothèse, nous avons construit donc une bobine Helmholtz octogonale paires champ magnétique système de compensation triaxial (bobines triaxiales), qui est en mesure d&#39;inverser précision les conditions normales du FMV. Nous avons utilisé Arabidopsis thaliana comme plante modèle et nous avons testé l&#39;effet de inversée GMF sur l&#39;expression génétique de certains gènes importants: cruciférine 3 (CRU3), qui code pour une protéine de stockage 12S de semence qui est la tyrosine phosphorylée et son état ​​de phosphorylation est modulée en réponse ABA dans les graines d&#39;Arabidopsis thaliana 12,13; Cuivre Transport protein1 (COTP1), qui code une protéine de la superfamille transport de métaux lourds / désintoxication avec la fonction prédominante dans le sol acquisition Cu et le développement du pollen 14; et Redox Facteur1 transcription sensible (de RRTF1),qui code pour un membre de l&#39;ERF (éthylène facteur de réponse) sous-famille B-3 de ERF / AP2 famille des facteurs de transcription qui contient un domaine AP2 qui facilitent la co-activation synergique de gène des voies d&#39;expression et leur confèrent une tolérance croisée à abiotiques et biotiques souligne 15. Par ailleurs, nous avons également analysé cinq gènes impliqués dans les réponses au stress oxydatif: Fe superoxyde Dismutase1, (FSD1), qui code pour une enzyme cytoplasmique qui convertit par voie enzymatique et rapidement l&#39;anion superoxyde (O 2 -) et d&#39;eau (H 2 O) au peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) et de l&#39;oxygène moléculaire (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), qui code pour et qui enzyme qui catalyse la décomposition de H 2 O 2 en eau et oxygène 17,18; ascorbate peroxydase thylacoïdales (tapX), qui code pour un peroxydase thylakoïde chloroplastique qui balaye H 2 O2 19; ascorbate Peroxidase1 (APX1), qui code pour une peroxydase cytosolique qui balaye H 2 O 2 et représente l&#39;une des cibles potentielles de modifications post-traductionnelles induites par des molécules dérivées NO 20; et NADPH respiratoire protéines rafale oxydase D (RbohD) qui code une enzyme qui génère O 2 - et joue un rôle essentiel dans la régulation de la croissance, le développement et la réponse au stress chez Arabidopsis 21. Notre méthodologie champ inversion fournit la première preuve que le FMV inversion peut induire un changement significatif dans l&#39;expression de la morphologie et le gène de A. racines et des pousses thaliana. Ce protocole fournit un moyen novateur pour évaluer l&#39;effet de la GMF inversion sur la morphologie de la plante et l&#39;expression des gènes et peut être utilisé pour évaluer l&#39;effet potentiel de retournement GMF sur d&#39;autres aspects du comportement de la plante, et ainsi guider la discussion de la role renversement de GMF sur l&#39;évolution de la plante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

L&#39;une des observations les plus stimulants dans l&#39;évolution des plantes est une corrélation entre la survenue de champ géomagnétique (GMF) reprises (ou excursions) et le moment de la radiation des Angiospermes. Cela a conduit à l&#39;hypothèse que les altérations de GMF polarité peuvent jouer un rôle dans l&#39;évolution des plantes. Ici, nous décrivons une méthode pour tester cette hypothèse en exposant Arabidopsis thaliana à inverser artificiellement conditions FMV. Nous avons utilisé un magnétomètre à trois axes et les données recueillies ont servi à calculer l&#39;ampleur de la GMF. Trois DC alimentations ont été connectées à trois paires de bobines de Helmholtz et ont été contrôlés par un ordinateur pour modifier les conditions du FMV. Les plantes cultivées dans des boîtes de Pétri ont été exposés à la fois normal et inversé conditions FMV. Expériences d&#39;exposition Sham ont également été réalisées. Plantes exposées ont été photographiés pendant l&#39;expérience et les images ont été analysés pour calculer la longueur des racines et des surfaces foliaires. Arabidopsis ARN total a été extrait et quantitativePCR en temps réel (qPCR) Les analyses ont été effectuées sur l&#39;expression du gène de la cruciférine 3 (CRU3), le transport du cuivre protein1 (COTP1), Redox Responsive Facteur1 transcription (RRTF1), Fe superoxyde dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), thylacoïdales ascorbate peroxydase (tapX), un ascorbate cytosolique Peroxidase1 (APX1), et le NADPH / respiratoires protéines rafale oxydase D (RbohD). Quatre gènes de référence différents ont été analysés afin de normaliser les résultats de la PCR quantitative. La meilleure des quatre gènes a été sélectionné et le gène le plus stable pour la normalisation a été utilisé. Nos données montrent pour la première fois que inversant la polarité GMF utilisant des bobines triaxiales a des effets importants sur la croissance des plantes et de l&#39;expression des gènes. Ce soutient l&#39;hypothèse que GMF inversion contribue à induire des changements dans le développement des plantes qui pourraient justifier une pression plus élevée sélective, pour aboutir finalement à pévolution lant.

L&#39;objectif de ce protocole est de fournir une méthode pour évaluer si l&#39;inversion du champ géomagnétique (GMF) peut affecter le développement de la plante et l&#39;expression du gène d&#39;Arabidopsis thaliana écotype Col 0. bobines triaxiales comme le montre la Figure 1A sont utilisés pour inverser la GMF quand ensemble avec les tensions de commande appropriées (figure 1b), obtenu comme décrit dans l&#39;étape 1.5 dans le protocole. Les dimensions des bobines triaxiales sont ~ 2 x 2 x 2 m 3, ce qui a permis un espace suffisant aux conditions FMV inversées pour accueillir plusieurs boîtes de Pétri. Les témoins ont été cultivées dans les mêmes conditions environnementales et à des valeurs normales du FMV. Après 10 jours d&#39;exposition à la normale et inversée conditions FMV, le phénotype des plantes a montré altérations morphologiques évidentes. Comme le montre la Figure 2, les plants témoins (par exemple, cultivées dans des conditions normales FMV) ont montré des racines avec des longueurs sensiblement Prob (Dunn-Sidak Bonferroni et corrigés &lt;0,001;T de Student = 10,68, df = 31) des valeurs plus élevées (29,41 mm; SEM = 1,04; n = 32) par rapport à des plantes exposées à inversée GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; n = 36). Chez les plantes GMF-inversées, la morphologie des pousses a également été modifié par un développement réduit représentant de l&#39;expansion de la valve. Plantes exposées à des conditions normales ont montré une superficie moyenne de feuilles de 4,95 mm 2 (SEM 0,025, N = 54), tandis que les plantes exposées à des conditions FMV inversées ont montré de manière significative (Dunn-Sidak et Bonferroni ajusté Prob = &lt;0,001; t de Student = 31.32, df = 53) des valeurs inférieures des feuilles de la région (3,71 mm 2; SEM = 0,032; n = 54). Par conséquent, l&#39;exposition à des conditions d&#39;Arabidopsis FMV inversées induit une réduction à la fois dans la longueur des racines et la surface foliaire. L&#39;expansion et la croissance Feuille racine dépendent à la fois la division et l&#39;élongation des cellules 27. Par conséquent, le développement de la plante, la productivité et la condition physique sont tributaires d&#39;une prise de vue et la racine système architecture optimale &lt;sup&gt; 28. La longueur des racines et des feuilles taille réduite des plantes exposées à des conditions FMV inversées indiquent la présence d&#39;un système de détection capable de percevoir non seulement les variations de l&#39;intensité du champ magnétique, mais aussi pour répondre aux changements dans le domaine de &quot;direction&quot; magnétique par rapport à la gravité. L&#39;hypothèse que le FMV inversion peut affecter la croissance de la plante trouve des preuves convaincantes dans nos expériences, qui démontrent que les conditions d&#39;inversion du FMV peuvent affecter de manière significative le développement de la plante. Les modifications morphologiques ont été accompagnés par des changements dans l&#39;expression génique. Parmi les gènes ménage, le gène le plus stable est le facteur d&#39;élongation 1B sous-unité alpha 2. Le premier groupe de gènes (CRU3, COTP1, RRTF1) a montré une altération dramatique dans l&#39;expression des gènes (Figure 3). Pousse expression de tous les trois gènes a été augmenté de façon significative (P &lt;0,05) d&#39;environ 2,5 fois dans les plantes exposées à la réserved conditions FMV. Expression de la racine de CRU3 a été régulée à la hausse dans les racines de plantes exposées à des conditions normales du FMV, mais était significative (P &lt;0,05) régulée à la baisse dans des conditions FMV inversées. L&#39;inverse a été trouvée pour COTP1 et RRTF1, qui ont été régulée à la baisse dans des conditions normales et régulée à la hausse dans la présence de GMF inversion (Figure 3). Cruciférine (une globuline 12 S) est une protéine de stockage le plus abondant dans les graines de A. thaliana et d&#39;autres crucifères et est synthétisé comme un précurseur dans le réticulum endoplasmique rugueux. Il est ensuite transporté vers les vacuoles de stockage de 13 protéines. Plantule germination exige la rupture de la cruciférine, qui est utilisé comme source initiale de l&#39;azote. La régulation de la dégradation cruciférine réduit le développement des embryons en altérant les structures cellulaires ou des composants cellulaires de développement 29,30. Nos résultats montrent que la régulation positive de CRU3 corrélation avecune expansion de la feuille inférieure et une longueur de racines réduit, ce qui indique que ce gène dans GMF sensible à l&#39;inversion et que sa surexpression peut contribuer à la réduction du développement de la plante. En outre, GMF induit une régulation à la baisse renversement significatif de CRU3 dans les racines, qui est en corrélation avec une longueur de racines réduit. Le cuivre est un cofacteur essentiel pour les processus clés dans les plantes, mais elle exerce des effets néfastes lorsque supérieures; Ainsi, la surexpression de transport du cuivre compromet la croissance des plantes. L&#39;effet de la GMF inversion était une surexpression significative de COTP1 dans les deux pousses et des racines, ce qui explique la croissance de la plante réduite. Le stress altère le métabolisme Ion chloroplaste, qui est étroitement liée à l&#39;état de la pile redox. Chez Arabidopsis RRTF1 le facteur de transcription est importante pour l&#39;expression de gènes associés à la possibilité d&#39;ajuster à des changements redox 31. Par conséquent, quand les plantes sont exposées à des stimuli externes capables de modifier leur développement physiologique etal programmes une surexpression de cet important facteur de transcription est attendue. Renversement de la GMF a induit une surexpression significative de RRTF1 dans les deux pousses et des racines, indiquant ainsi plus élevés de stress oxydatif réponses des plantes aux conditions FMV inversées. Des résultats intéressants sont obtenus en analysant les cinq gènes impliqués dans le stress oxydatif. En général, tous les gènes extraites et analysées dans les pousses ne montrent pas de différences significatives (P&gt; 0,05) lorsque les plantes ont été cultivées dans des conditions normale ou inversée FMV (figure 4 et figure 5). Cependant, une régulation à la baisse significative a été observée chez toujours racines des plantes exposées à des conditions FMV inversées. En particulier, CAT3 a montré la plus forte régulation à la baisse (figure 5), suivie dans l&#39;ordre de la régulation négative par APX1, FSD1, RBOHD et tapX (Figure 4). Tolérance à une Croixstress biotique et abiotique est fourni par l&#39;activation des différents gènes impliqués dans plusieurs voies biochimiques. RRTF1 facteur de transcription facilite le co-activation synergique de l&#39;expression génique de ces voies 15,31, et peut être potentiellement impliqué dans le stress oxydatif 32. Par conséquent, la régulation positive de RRTF1 est attendue lorsque piégeage de l&#39;oxygène est réduite. Régulation à la baisse des enzymes d&#39;élimination des racines est corrélée avec la régulation à la hausse de RRTF1, qui agit en réponse à une augmentation du stress oxydatif. La régulation à la baisse de la racine dramatique de CAT3, APX1 tapX et indique la capacité réduite des cellules de la racine à nettoyer H 2 O 2, qui est accompagné par la capacité réduite à dismuter l&#39;anion superoxyde par la régulation négative de FSD1. Les réponses de stress oxydatif est plus élevé dans les racines, qui semblent être le site principal de la perception inversée GMF. Figure système de compensation de champ 1. géomagnétique. (A) des bobines triaxial (comprenant une paire de bobines de forme octogonale pour chacun des trois axes perpendiculaires) utilisés pour inverser le vecteur champ géomagnétique. (B) Un bloc d&#39;alimentation commandé par ordinateur est relié à chaque paire de bobines de Helmholtz. (Tensions dans ces chiffres sont arbitraires) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Figure 2. Effets d&#39;inversion du champ magnétique terrestre sur le terrain sur Arabidopsis morphologie. Après dix jours de l&#39;exposition, les plantes de contrôle (par exemple, ceux qui sont exposés à des conditions normales FMV) montrent un nombre significativement plus la longueur des racines et plus expandépliants ded comparées à des plantes qui ont été exposés à des conditions FMV inversées. Metric bar = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Figure 3. Effets d&#39;inversion du champ géomagnétique sur l&#39;expression des gènes d&#39;Arabidopsis. Au bout de dix jours d&#39;exposition, l&#39;ARN total de contrôle et les plantes traitées a été extrait et analysé par PCR en temps réel pour l&#39;analyse d&#39;expression. L&#39;effet de renversement de la GMF était d&#39;induire un changement radical dans l&#39;expression du gène de tous les gènes qui ont été testés CRU3, cruciférine 3;. COTP1, cuivre Transport protein1; RRTF1, Redox Responsive Facteur1 transcription. Bars indiquent l&#39;erreur type; astérisques indique significative (p &lt;0,05) différences entre les plfourmis exposées à des conditions FMV inversés et normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Figure 4. Effets de inversion du champ géomagnétique sur Arabidopsis expression du gène lié antioxydant. Au bout de dix jours d&#39;exposition, l&#39;ARN total de contrôle et les plantes traitées est isolé et utilisé pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique en utilisant PCR en temps réel. L&#39;effet de renversement de la GMF était d&#39;induire aucun changement significatif dans l&#39;expression du gène de tournage; cependant, une régulation à la baisse drastique a été observée dans l&#39;expression des gènes des racines des plantes cultivées dans des conditions FMV inversées tapX, thylacoïdales ascorbate peroxydase;. APX1, ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe superoxyde Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoire rafale oxydase protéine D Bars indiquent l&#39;erreur type; astérisques indique significatives (P &lt;0,05) différences entre les plantes exposées à des conditions normales et FMV inversées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Figure 5. Effets de l&#39;inversion du champ magnétique terrestre sur le terrain sur Arabidopsis catalase 3 (CAT3) l&#39;expression des gènes. Au bout de dix jours d&#39;exposition, l&#39;ARN total de contrôle et les plantes traitées est isolé et utilisé pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique en utilisant PCR en temps réel. L&#39;effet de renversement de la GMF était d&#39;induire aucun changement significatif dans l&#39;expression du gène de tournage; cependant, une régulation à la baisse drastique a été observée dans l&#39;expression des plantes cultivées sous conditions FMV inversées du gène de la racine. Les barres indiquent une erreur normer; astérisques indique significatives (P &lt;0,05) différences entre les plantes exposées à des conditions normales et FMV inversées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Champ géomagnétique (FMV) et Evolution des végétaux: Étude des effets de la GMF Reprise sur<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Développement et Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K vues.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Vidéo: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Recherche

Biologie du développement

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

Évaluation des effets des composés sur le développement du réseau de neurones vertébrés fonction à l’aide de rangées d’électrodes multiples de perturbateurs endocriniens

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...