This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été manipulés dans des protocoles approuvés par le centre de logement des animaux de l&#39;Université de Valladolid, en accord avec la Convention européenne 123 / Conseil de l&#39;Europe et de la directive 86/609 / CEE. 1. Culture à court et à long terme des neurones de l&#39;hippocampe de rat <ol><li> Préparation de la poly-D-lysine recouvert de 12 mm des lamelles de verre. <ol><li> Stériliser 12 mm lamelles de verre de diamètre dans l&#39;éthanol pendant au moins 24 heures. Laissez-les sécher dans des conditions stériles. </li><li> Répartir les lamelles sur une bande de parafilm dans une boîte de Petri. Recouvrir la surface de chaque lamelle avec 200 ul de 1 mg / ml de poly-D-lysine. Autoriser le traitement O / N. </li><li> Le lendemain, laver les lamelles avec de l&#39;eau stérile distillée deux fois toutes les 15 min pendant 90 min dans des conditions stériles. </li><li> Remplir une plaque de quatre puits multiple à avec 500 pi de Neurobasal milieu de culture par puits. Neurobasal milieu de culture doit être complétée par10% de sérum de veau fœtal, 2% de B27, 1 ug / ml de gentamicine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Placez les lamelles dans la plaque multiple à. Les maintenir dans une humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Isolement des neurones de l&#39;hippocampe de rats nouveau-nés. <ol><li> Préparer 1,8 ml de solution de papaïne (directement acheté) dans un flacon (20 ul / ml) dans des conditions stériles: Pour obtenir une concentration finale de 20 ul / ml, ajouter environ 40 ul de la papaïne dans 1,8 ml de Hank plus 0,6% de BSA (pi doivent être calculés selon les conditions des fabricants). 0,6% de BSA de Hank est préparée en mélangeant 85 ml de milieu HBSS avec 15 ml d&#39;albumine de sérum bovin à 4% (BSA, préparé résolution de 4 g de BSA dans 100 ml de HBSS). Préparer dans une hotte stérile. </li><li> Incuber la papaïne dans Hank plus 0,6% de BSA pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation. Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um avant utilisation. </li><li> Préparer le milieu F-12 de Ham en ajoutant DulbeccoModifié Moyen poudre de Eagle (13,5 g par litre) dans 900 ml d&#39;eau stérile doublement distillée. Ensuite, ajoutez 6 g HEPES et 336 mg de NaHCO 3 et ajuster le pH à 7,42 en utilisant NaOH 4 N. Ajouter de l&#39;eau stérile afin d&#39;obtenir une solution à 1 L et filtrer à l&#39;aide d&#39;une polyéthersulfone 0,20 um (PSE) Bottle Top filtre. Effectuer ce processus dans une hotte stérile. Enfin saturer la solution avec CO 2 dans des conditions stériles avant utilisation. Solutions de conserver à 4 ° C et les utiliser réfrigérés. </li><li> Euthanasier nouveau-né (P0) ratons par décapitation et laver la tête en milieu HBS stérile. Ouvrez le crâne à l&#39;aide de ciseaux stériles. Extraire le cerveau avec une spatule et laver rapidement en F-12 du milieu de Ham. </li><li> Faire une coupe en diagonale à l&#39;aide d&#39;un scalpel dans chaque hémisphère (figure 1B), et de la porter à une boîte de Pétri contenant F-12 du milieu de Ham. </li><li> Méninges Jeter soigneusement avec l&#39;aide de pinces à dissection et sous une loupe. </li> &lt;li&gt; Identifier l&#39;hippocampe dans un emplacement concave caractéristique sur le cortex utilisant loupe. Ensuite, séparer l&#39;hippocampe du cortex en tirant délicatement d&#39;une frontière et de la retirer de sa position à l&#39;aide des ciseaux pour les yeux. </li><li> Transférer le tissu hippocampique à une plaque 4-bien rempli avec le milieu dépourvu de Ca 2+ et Mg 2+ stérile de Hank plus 0,6% de BSA et laver tissu hippocampique. Sans enlever les médias couper le tissu en petits morceaux (environ 2 x 2 mm) en utilisant les mêmes ciseaux oculaires. </li><li> Transférer des morceaux de l&#39;hippocampe dans un flacon contenant 1,8 ml de solution de papaïne pré-filtrée. Puis les incuber à 37 ºC avec occasionnelle, agitant doucement. 15 min plus tard, ajouter 90 ul de solution de DNase I (50 ug / ml final) et incuber pendant 15 min supplémentaires. </li><li> Transférer le tissu à un tube de centrifugeuse de 10 ml et laver les fragments avec des produits frais Neurobasal milieu de culture. Obtenir suspension cellulaire en passant des fragments de tissu à travers un 5 ml en plastique pipette. </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 160 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en plastique et suspendre pastille soigneusement avec une pipette automatique de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture Neurobasal. </li><li> Mesurer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage Neubauer. Mettez la lamelle de verre au-dessus de la chambre de Neubauer. Ajouter 10 ul de suspension cellulaire. Assurez-vous que la suspension de cellules pénètre dans la chambre de manière uniforme et sans faire de bulles. Comptez le nombre de cellules sous le microscope et effectuer des calculs correspondants pour obtenir une baisse appropriée de 40-80 ul contenant 30 x 10 3 cellules. Le nombre total de cellules dépendra du nombre d&#39;animaux utilisés. </li></ol></li><li> À court terme et à long terme de la culture des neurones d&#39;hippocampe de rat. <ol><li> Sur la plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de Neurobasal milieu de culture préparé avant et conservés dans l&#39;incubateur, la plaque d&#39;environ 30 x 10 3 cellules dans une chute d&#39;environ 50 pi à chaquepuits de la plaque contenant une boîte multiple poly-D-lysine-enduit, 12 mm lamelle de verre de diamètre. </li><li> Maintenir cellules de l&#39;hippocampe primaires dans un humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur pendant 2-5 jours in vitro (DIV, à court terme, les cultures jeunes) ou&gt; 15 DIV (à long terme, les cultures âgées) avant les expériences sans changer la culture médias. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescence Imaging de cytosolique de Ca 2+ Concentration <ol><li> Préparation des solutions d&#39;essai pour l&#39;imagerie de fluorescence. <ol><li> Préparer une solution saline externe tamponnée HEPES (HBS) contenant, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 glucose, le sodium-10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Préparer un exempt externe, Mg 2+, une solution saline tamponnée HEPES (HBS) solution contenant, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, le glucose 10 et 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Résolvez saline NMDA dans Mg 2+ exempt, tamponné HEPES (HBS) à une final concentration de 100 uM et de compléter avec 10 uM glycine. </li><li> Préparer une solution HBS contenant KCl au lieu de NaCl en résolvant (en mM): 145 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, le glucose et 10 HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> Chargement des cellules de l&#39;hippocampe avec sonde fluorescente de calcium fura2 / AM. <ol><li> Prenez la culture cellulaire contenant des lamelles de l&#39;incubateur et les laver avec un milieu à température ambiante HBS en les transférant à une nouvelle plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de HBS par puits. </li><li> Incuber les cellules avec fura2 / AM 4 pm (préparés dans le même milieu HBS) pendant 60 min à température ambiante (25 ° C) dans un endroit sombre. </li><li> Après 60 min, laver lamelles avec un milieu HBS frais. </li></ol></li><li> Enregistrement des images de fluorescence cytosolique [Ca2 +] dans des cellules en culture. <ol><li> Allumez la lampe, microscope, système de perfusion, un appareil photo de fluorescence et l&#39;ordinateur. </li><li> Placez les lamelles dans une plate-forme pour thermostatéouverts 12 mm lamelles de verre sur la scène du microscope inversé et sélectionnez un champ microscopique en utilisant un objectif 40X (huile, NA: 1,3). Perfuser cellules en continu avec préchauffé (37 ºC) moyen HBS en l&#39;absence ou la présence de substances d&#39;essai. Maintenir le débit à une vitesse d&#39;environ 5-10 ml / min. Remarque: Cellule système de perfusion de cellules vivantes est montée dans une plate-forme ouverte pour thermostaté 12 mm lamelles de verre. 8 lignes du système de perfusion par gravité équipé d&#39;un dispositif de commande de soupape est utilisé pour perfuser les solutions. Une pompe à vide est responsable de l&#39;enlèvement tout support excès. Les solutions sont chauffées au moyen d&#39;un système de chauffage en tube. </li><li> Capturer une image de fond avec l&#39;obturateur fermé à deux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li><li> Epi-éclairer cellules alternativement à 340 et 380 nm. La lumière d&#39;enregistrement émise à 520 nm toutes les 5 à 10 secondes avec un appareil photo de fluorescence, qui est filtré par un miroir dichroïque fura-2. </li><li> Lorsque la période d&#39;enregistrement est terminé, mémoriser la séquence complète oimages f émis à 520 nm dans l&#39;ordinateur pour une analyse ultérieure. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des images fluorescentes enregistrées. <ol><li> Ouvrez le fichier de l&#39;expérience. Utilisation du logiciel de aquacosmos, cliquez sur &quot;Ratio&quot; et sélectionnez la plage de rapport désiré. Calculer le pixel par rapport à des pixels les images résultantes pour obtenir une séquence d&#39;images de rapport. </li><li> Soustraire fond en ajustant le &#39;élimination de fond ». De calcul de démarrage &#39;Press. </li><li> Appuyer sur le bouton et d&#39;effacer les anciennes régions d&#39;intérêt séquence tous les temps »(Rois). Pour l&#39;analyse quantitative des cellules individuelles, établir de nouvelles régions d&#39;intérêt ou ROI correspondant aux neurones individuels. Moyenne de toutes les valeurs de rapport à chaque pixel correspondant à chaque ROI et chaque image afin d&#39;obtenir un enregistrement de valeurs de fluorescence de rapport pour chaque ROI (cellules). </li><li> Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels exporter les valeurs rapport de fluorescence correspondant à chaque ROI à un progr graphiqueun m. </li><li> Faites les calculs correspondants pour estimer la taille de la hausse du ratio fluorescences en réponse à chaque stimulation à l&#39;aide d&#39;une analyse de données approprié et graphiquement logiciel. </li></ol></li></ol> 3. La bioluminescence imagerie de mitochondrial Ca 2+ Concentration <ol><li> La transfection de neurones hippocampiques en culture avec le plasmide mitGAmut. REMARQUE: Les cellules sont transfectées avec le premier plasmide contenant une séquence mitGAmut de mitochondries ciblée et une aequorine mutée manque un site de liaison de Ca2 + fusionné à la protéine fluorescente verte (GFP). Cette construction détecte fortes augmentations en Ca2 + mitochondrial absorption et permet d&#39;identifier les cellules transfectées par la fluorescence de la GFP. Le plasmide a été développé et a aimablement fourni par P. Brûlet et ses collègues 18 (CNRS, Paris). <ol><li> Préparer Neurobasal TF, contenant Neurobasal milieu de culture, sans sérum de veau foetal, B27, gentamicet 2 mM de L-glutamine. </li><li> Préparer 50 ul de Neurobasal TF ainsi 2,5 ul réactif de transfection dans un flacon (solution A). Préparer 50 ul de Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut plasmide dans un flacon (solution B). Ajouter délicatement la solution B en solution A. Laisser le mélange pendant 20 min, sans agitation. </li><li> Transférer les lamelles contenant les neurones hippocampiques à de nouvelles plaques Multidish contenant 200 pi de Neurobasal TF frais. </li><li> Ajouter goutte à goutte 100 pi de solution A + B sur chaque lamelle. Incuber pendant 30 min. Retirer le moyen. Laver une fois les cellules avec Neurobasal TF frais. Retourner les lamelles à l&#39;original Neurobasal milieu de culture. </li><li> Les neurones de culture pour une 24 heure supplémentaire à 37 ° C et 5% de CO 2 après la transfection pour permettre l&#39;expression efficace et le ciblage de la sonde. </li></ol></li><li> Préparation de solutions de test pour l&#39;imagerie par bioluminescence. <ol><li> Préparer des solutions HBS contenant NMDA 100 um ou 145 mM de KCl queci-dessus (étape 2.1). Préparer une solution contenant HBS mM Ca 2+, plus 10 digitonine 100 um. </li></ol></li><li> Reconstitution de aequorine mitochondries ciblée avec coelentérazine n. <ol><li> Lamelles de transfert contenant les neurones hippocampiques transfectées à une plaque de quatre puits contenant 200 pi de HBS. </li><li> Ajouter 4 ul de coelentérazine n (200 uM) à 200 ul de HBS pour une concentration finale de 4 uM et mélanger doucement. Incuber pendant 2 heures à température ambiante (25 ° C) et dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Enregistrement d&#39;images de bioluminescence de mitochondrial [Ca2 +]. <ol><li> Allumer le microscope, la lampe, le système de perfusion, de bioluminescence caméra et l&#39;ordinateur. </li><li> Transfert lamelles reconstituées à un (37 ºC) chambre de perfusion thermostaté et perfuser constamment avec une solution HBS préchauffé à un taux de 5-10 ml / min. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 40X (huile, NA: 1,3), sélectionner un champ microscopique contenant des cellules exprimant l&#39;unpoaequorins comme indiqué par émission de fluorescence associée à l&#39;expression de la protéine fluorescente verte (GFP) en utilisant les filtres FITC. Un champ typique peut contenir 1-2 cellules transfectées. Capturer l&#39;image de fluorescence de la GFP, en utilisant une caméra CCD. </li><li> Éteignez la lumière du microscope. Retirer la boîte contenant dichroïque situé dans la voie de la lumière. Éteignez la lumière d&#39;excitation et fermer la boîte noire pour l&#39;obscurité complète. </li><li> Perfuser les cellules à 5-10 ml / min avec un milieu HBS avec ou sans solutions de test pré-chauffé à 37 ° C. </li><li> Capturer des images d&#39;émissions photoniques toutes les 10 s avec un appareil de comptage de photons manipulés avec un processeur d&#39;image. </li><li> À la fin de chaque expérience, perméabiliser les cellules avec 0,1 mM digitonine dans 10 mM de CaCl2 dans HBS afin de libérer toutes les émissions photoniques restants. Remarque: Ces émissions photoniques doivent être additionnés afin d&#39;estimer les émissions totales photoniques, une valeur requise pour l&#39;étalonnage de concentrations de Ca2 + &lt;./ li&gt; <li> Images de bioluminescence de magasin dans l&#39;ordinateur avec l&#39;image de fluorescence de la GFP associé capturés avant l&#39;imagerie à comptage de photons. </li></ol></li><li> L&#39;analyse d&#39;images de bioluminescence reflétant mitochondrial [Ca2 +]. <ol><li> Quantifier les émissions photoniques utilisant un logiciel spécifique. Émissions photoniques peuvent être convertis en Ca 2+ libre mitochondrial concentration ([Ca2 +] mit) en utilisant l&#39;algorithme décrit par Brini et al. 15. </li><li> Ouvrir l&#39;expérience et l&#39;image de fluorescence de la GFP. Sélectionnez régions d&#39;intérêt (ROI) avec l&#39;aide d&#39;un logiciel spécifique en dessinant la forme des cellules transfectées selon les images de fluorescence capturés au début de l&#39;expérience. </li><li> Collez les mêmes ROI sur chaque image. Le total des émissions photoniques dans chaque ROI sont calculées avec le logiciel spécifique pour obtenir la valeur d&#39;émission de luminescence (L) pour chaque cellule à chaque point dans le temps. </li><li> Ajouter tout le SIGE photoniquedes ions dans les images de bioluminescence, y compris ceux obtenus après perméabilisation digitonine, en utilisant le logiciel spécifique, pour obtenir une image de bioluminescence contenant toutes les émissions photoniques. </li><li> La valeur des exportations des émissions photoniques pour chaque région d&#39;intérêt à un logiciel spécifique pour les calculs. Pour ce faire, cliquez sur &quot;Graph&quot; afin de calculer les valeurs de bioluminescence pour chaque ROI à chaque fois. Sélectionnez «valeur totale» et «utiliser ROI actuelle à toutes les images. Appuyez sur &#39;Calculer&#39;. Enregistrez le &#39;txt.file&#39; et exporter des données vers une feuille de calcul. Pour chaque ROI, [Ca 2+] mit est calculé en utilisant l&#39;algorithme suivant: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; où, R = [L / (L totale λ)] 1 / n L est la luminescence émise au moment de la mesure dans chaque région d&#39;intérêt. L total estla luminescence totale restant après l&#39;addition des chiffres présents dans le tissu à ce moment au moment de la mesure pour chaque région d&#39;intérêt. λ, TR K, K R et n sont des constantes dont les valeurs dépendent combinaison de aequorine (type sauvage ou muté) et coelenterazin utilisé (type sauvage ou de type n) ainsi que la température 16 enregistrement. Pour la combinaison utilisée ici (muté AEQ et coelenterzine n), à 37 ºC, nous avons utilisé les valeurs suivantes: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 et λ = 0,138. </li></ol></li><li> Faites les calculs correspondants pour estimer la taille des hausses de bioluminescence en réponse à chaque stimulus utilisant une analyse de données approprié et graphiquement logiciel. </li></ol>

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	<li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death.">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li><li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones.">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li><li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture.">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li><li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells.">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li><li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs:+role+of+mitochondrial+calcium.">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo.">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li><li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors.">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li><li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture:+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current,+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels.">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li><li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake.">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li><li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li><li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction:+behavioral,+electrophysiological+and+morphological+perspectives.">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li><li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro.">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li><li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2++concentration+([Ca2+]c).+A+critical+evaluation.">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li><li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garc&#236;a-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles.">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li><li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+Ca2++among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells.">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Le remodelage de Ca 2+ intracellulaire homéostasie dans le cerveau de vieillissement a été liée à la perte cognitive, une susceptibilité accrue aux lésions ischémiques, excitotoxicité et la neurodégénérescence. Pour vérifier cette hypothèse in vitro, les procédures d&#39;imagerie de CA sont disponibles. Malheureusement, cultures viables de vieux neurones de l&#39;hippocampe ne sont pas fiables. Récemment, il a été observé que les cultures à long terme de neurones d&#39;...

L&#39;excitotoxicité est l&#39;un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l&#39;ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer 1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur ​​Ca 2+ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) 2. L&#39;exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité 3, ce qui provoque l&#39;apoptose neuronale 4. Nous et d&#39;autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité neuronale à l&#39;apoptose induite par le NMDA peut changer avec le développement in vitro et le vieillissement de 5-8. Il est largement admis que l&#39;augmentation de la libre cytosolique-concentration de Ca 2+ ([Ca 2+] CYT) conduit à l&#39;activation des cellules. Toutefois, si cette hausse est trop élevée et / ou assez soutenue, il peut déclencher la mort cellulaire 9. En outre, il a été proposéque excitotoxicité nécessite Ca 2+ mitochondrial absorption 10, puisque le traitement des neurones avec un neurones découplant mitochondrial protégées contre induite par le glutamate mort cellulaire 11. Si mitochondries prennent trop de Ca 2+, de l&#39;ouverture du pore de transition mitochondrial perméabilité peut se produire, conduisant à la libération de cytochrome c et d&#39;autres facteurs pro-apoptotiques, et induisant l&#39;apoptose. Nous avons récemment montré que cette mitochondrial Ca2 + absorption est directement liée à la sensibilité dépendant de l&#39;âge à l&#39;excitotoxicité, en mesurant directement NMDA induite par Ca2 + mitochondrial absorption dans les neurones hippocampiques individuelles 5, un procédé qui est indiqué dans cet article. L&#39;hippocampe, impliquée dans les processus physiologiques tels que l&#39;apprentissage, la mémoire et d&#39;autres processus cognitifs 12, est très vulnérable au vieillissement et les troubles neurodégénératifs 13. Il a été proposé que, après plusieurs semaines in vitro, en cultureneurones de l&#39;hippocampe montrent un certain nombre de caractéristiques typiques des neurones âgées de 14. En conséquence, les neurones d&#39;hippocampe en culture à long terme peuvent fournir un modèle global pour enquêter Ca 2+ mécanismes médiées de excitotoxicité accrue dans le vieillissement. L&#39;objectif global de la méthode présentée est, par conséquent, pour enquêter sur des changements substantiels dans l&#39;homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou Ca 2+ remodelage dans le vieillissement du cerveau, y compris les réponses de l&#39;écart Ca induites par des agonistes des récepteurs NMDA dans un long-terme neurones d&#39;hippocampe en culture . Le procédé comprend une description détaillée de la culture des neurones d&#39;hippocampe de rat et de la surveillance des concentrations de Ca2 + cytosolique et mitochondriale par fluorescence et l&#39;imagerie par bioluminescence dans les neurones individuels, respectivement. Imagerie de fluorescence de Ca2 + cytosolique dans des neurones en culture est une procédure standard. Cependant, cette méthode est moins fiable pour souscellulaire, y compris les mesures de Ca2 + mitochondrial Ca 2+. Les raisons en sont le manque de ciblage des sondes synthétiques et d&#39;affinité inapproprié pour concentrations de Ca2 + qui peuvent changer dans les mitochondries du niveau de iM faible, même au niveau mM. L&#39;utilisation de Ca 2+ sondes à base de protéines comme par exemple l&#39;aequorine, a permis de cibler les organelles subcellulaires et à l&#39;utilisation de dérivés différentes affinités Ca2 + en utilisant différentes sondes ou cœlentérazines mutées dépourvues de Ca 2+ spécifique 15 sites de liaison. De cette manière, l&#39;imagerie par bioluminescence de cellules exprimant l&#39;aequorine mitochondriale ciblée peut permettre le contrôle des concentrations de Ca2 + mitochondrial dans des neurones individuels. Pourtant, cette procédure peut nécessiter l&#39;utilisation de caméras de comptage de photons ou des caméras CCD ultrasensibles pour la bioluminescence imagerie 16-18. Cette méthode peut donner de nouveaux résultats qui devraient être confirmée dans plus establMINE modèles de vieillissement du cerveau que, par exemple, des tranches de cerveau de vieux animaux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

La sensibilité à la mort cellulaire neuronale associée à la neurodégénérescence et l&#39;ischémie sont extrêmement augmentée dans le cerveau mais vieilli mécanismes responsables sont mal connus. L&#39;excitotoxicité, un processus censé contribuer à des lésions des neurones induite par les deux injurieux, est médiée par l&#39;activation des récepteurs du glutamate, qui favorise l&#39;influx de Ca2 + et Ca2 + mitochondrial surcharge. Un changement important dans l&#39;homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou remodelage de Ca2 + intracellulaire homéostasie peut favoriser des dommages neurone dans les vieux neurones. Pour étudier le remodelage de Ca2 + dans le vieillissement, nous avons utilisé l&#39;imagerie de cellules vivantes dans les cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat qui ressemblent à certains égards neurones in vivo âgés. Pour cette fin, cellules de l&#39;hippocampe sont, en premier lieu, fraîchement dispersé de nouvelles hippocampes né de rat et plaqués sur des lamelles couché, verre poli-D-lysine. Puis les cultures sont conservés dans les médias contrôlés pendant plusieurs jours ou plusieurs wEeks pour enquêter jeunes et vieux neurones, respectivement. Deuxièmement, des neurones en culture sont chargés avec fura2 et soumis à des mesures de la concentration cytosolique de Ca2 + en utilisant l&#39;imagerie de fluorescence de rapport numérique. Troisièmement, des neurones en culture sont transfectées avec des plasmides exprimant un tandem de faible affinité équorine et la GFP ciblée vers les mitochondries. Après 24 heures, l&#39;aequorine l&#39;intérieur des cellules est reconstitué avec coelentérazine et les neurones sont soumis à l&#39;imagerie par bioluminescence pour la surveillance de la concentration en Ca2 + mitochondrial. Cette procédure en trois étapes permet la surveillance des réponses mitochondriaux et cytosoliques Ca2 + à des stimuli appropriés comme par exemple l&#39;agoniste des récepteurs du glutamate NMDA et de comparer si ces réponses et d&#39;autres sont influencés par le vieillissement. Cette procédure peut donner de nouvelles indications sur la façon dont le vieillissement influence cytosolique et les réponses Ca 2+ mitochondriales à des stimuli sélectionnés ainsi que les essais de médicaments sélectionnés visant à prévenir neuronela mort dans les maladies liées à l&#39;âge.

Nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer le remodelage de Ca2 + et les effets de NMDA sur cytosolique et mitochondriale [Ca2 +] dans les neurones ans. La figure 1 montre le schéma de la procédure d&#39;isolement et de culture de neurones de l&#39;hippocampe des rats nouveau-nés. Avant de commencer, nous devons nous préparer, enduits, lamelles stériles poly-D-lysine verre et de les localiser dans un plat 4 puits. Ensuite, les rats nouveau-nés sont tués et enlevé...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K vues.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Recherche

Neurosciences

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

De l&#39;imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.