Ce travail est soutenu par le programme Rowland boursier junior. Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude aux scientifiques et le personnel de l&#39;Institut Rowland à Harvard: Chris Stokes pour son aide dans le développement de l&#39;, dispositif de contrôle de pression assistée par ordinateur sur mesure, Diane Schaak, Ph.D. pour sa contribution à la manipulation des échantillons biologiques, Winfield Hill pour développer l&#39;installation électrique, Alvaro Sanchez, Ph.D. d&#39;accorder l&#39;accès à la cytométrie en flux, Scott Bevis, Kenny Spencer et Don Rogers pour l&#39;usinage de pièces de plomberie mécaniques requises pour la configuration de pression. Maîtres microfluidiques ont été fabriqués au Centre pour les systèmes à l&#39;échelle nanométrique (CNS) à l&#39;Université de Harvard.

1 Préparation des cellules <ol><li> Planche 1 × 10 5 cellules / ml de la lignée cellulaire de cancer du sein métastatique MDA-MB-231 dans un volume de 10 ml par culture de tissus T75 ballon en milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% (v / v) de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. </li><li> Incuber les cellules MDA-MB-231 cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 0% de CO 2 environnement. </li><li> Récolte des cellules pour les expériences 2 jours après l&#39;ensemencement des cellules par traitement avec 0,25% de trypsine-EDTA pendant 2 min et inactiver l&#39;activité enzymatique de la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de croissance. </li><li> un culot de cellules par centrifugation pendant 5 min à 200 x g et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x sans Ca 2 + et Mg 2 +) à une concentration finale de 5 x 10 5 cellules / ml. </li></ol> 2. Dispositif Conception et fabrication REMARQUE: Le masque, fabrications maître de moisissure et laprocessus d&#39;enceinte de microcanaux doivent être menées à l&#39;intérieur d&#39;une salle blanche tandis que le polydiméthylsiloxane (PDMS) procédé de coulée de microcanaux peut être effectuée sur une paillasse de laboratoire régulière. <ol><li> Conception d&#39;un dispositif microfluidique, comme illustré sur la figure 1 avec AutoCAD. Le dispositif devrait être composé d&#39;une entrée avec des ports d&#39;injection multiples, filtres grossiers et deux inertie en se concentrant canaux rectangulaires droites parallèles (L = 7 mm, W = 40 um, et H = 70 pm). Chaîne droite individuelle se compose de cinq chambres d&#39;électroporation, qui sont placés en dehors de 800 um (C = W 400 um) avec deux trous d&#39;interconnexion des électrodes d&#39;aluminium. Deux chambres d&#39;électroporation transversalement adjacents partagent le trou de l&#39;électrode négative. Deux chaînes droites fusionnent en une sortie à l&#39;aval de la région d&#39;électroporation. </li><li> Convertir le fichier CAO avec des micro-modèles dans un fichier GDSII utilisant LinkCAD. Ecrire les micro-motifs sur un 5 &quot;x 5&quot; photomasqueavec un graveur de masque laser. Développer le masque en suivant le protocole du fabricant. REMARQUE: Le processus de développement de masque comprend résine photosensible développement, la gravure de chrome et résister à l&#39;enlèvement. Sinon, micro-motifs imprimés sur un transparent à haute résolution (&gt; 20 000 ppp) peut être acheté auprès d&#39;un fabricant tiers et utilisé comme un masque photographique. Fonctions à micro-finales sur un photomasque devraient être transparentes pour correspondre à la polarité d&#39;une résine photosensible négative. </li><li> Fabriquer le moule de coulée de la conception du dispositif en utilisant des techniques classiques de lithographie douce 23 avec une couche photosensible négative filé sur une tranche de silicium de 4 pouces à 2000 tours par minute pour avoir l&#39;épaisseur finale de 70 pm. </li><li> Précuites la plaquette de résine photosensible négative pendant 20 min à 95 ° C. </li><li> Contacter le masque avec la tranche et exposer à une source d&#39;UV (17,4 mJ / cm 2) pendant 80 secondes en utilisant un aligneur de masque. </li><li> Développer la tranche exposée pendant 4 minutes dans un révélateur SU-8. </li><li> Mesurer l&#39;l&#39;épaisseur de la résine photosensible développée en utilisant un profilomètre de surface. </li><li> Rigoureusement mélanger un ratio de 10: 1 en élastomère à l&#39;agent (kit d&#39;élastomère de silicone) le durcissement et versez le mélange sur le moule pour produire des répliques PDMS. Dégazer l&#39;élastomère de coulée pendant 30 minutes et traiter le moule de coulée d&#39;élastomère dégazé dans une étuve à 70 ° C pendant 2 heures. </li><li> Décoller guéri réplique PDMS avec des motifs de microcanaux du moule et percer des trous pour les entrées, sorties et électrodes insertions en utilisant un étau broches. Remarque: le diamètre de bord de coupe normale de l&#39;étau de la broche doit être de 0,76 mm, suffisante pour maintenir fermement un tube en PEEK (OD de 1/32 &quot;) et des électrodes en aluminium (DO de 0,029&quot;) à la place. </li><li> Créer des canaux microfluidiques fermés par collage PDMS répliques sur une lame de verre traitée dans un nettoyeur à plasma d&#39;oxygène pendant 7 secondes à une puissance et pression partielle d&#39;oxygène de 75 W et 500 mTorr, respectivement fréquence radio. </li></ol> 3. Expériences de débit <ol><li> Insérerdes électrodes d&#39;aluminium (0,029 &quot;) de diamètre extérieur et un tube de sortie de PEEK (1/32&quot; DO) en des endroits désignés par l&#39;intermédiaire de trous dans les microcanaux (voir la figure 3B). </li><li> Brancher l&#39;équipement électrique 18 responsable de la production à haute tension de courtes impulsions rectangulaires aux électrodes d&#39;aluminium (voir la figure 3C) qui sont en contact avec des solutions qui coule dans le moule PDMS. REMARQUE: L&#39;équipement devrait être composé d&#39;un générateur d&#39;impulsions et d&#39;un amplificateur de haute tension dans la maison construite 18. </li><li> Préparer 50 ml de quatre tubes à centrifugation contenant individuellement DPBS, des solutions avec des cellules et des biomolécules, et fixer chaque tube à son support de flacon respectif connecté au système de commande d&#39;écoulement pneumatique (voir la figure 3A) 18. </li><li> Connecter le tuyau d&#39;PEEK entrée des détenteurs des flacons dans les trous d&#39;entrée respectives dans le dispositif microfluidique. </li><li> Réglez l&#39;amplitude d&#39;impulsions rectangulaires, V, 100 V afin d&#39;avoir la FIE électriquerésistance à ld, E = V / e L, à travers la chambre d&#39;électroporation être équivalent à 0,7 kV / cm. NOTE: Ici, L e est la distance entre deux points où les électrodes positive et négative sont en contact avec la solution qui s&#39;écoule (voir figure 1). </li><li> Régler le régulateur de pression de 40 psi. REMARQUE:. Une source d&#39;azote réglable manuellement unique est utilisé pour mettre sous pression de manière uniforme tous les flacons d&#39;échantillon et un collecteur à haute vitesse est utilisé pour activer en temps opportun des ports individuels de la solution en utilisant le logiciel LabVIEW intégré personnalisé 18 </li><li> Pour le contrôle de la vanne, ouvrir le logiciel intégré de LabVIEW personnalisé appelé Valve Runner, et cliquez sur Exécuter dans le menu déroulant intitulé fonctionnent. </li><li> Ouvrir les robinets en cliquant sur l&#39;icône de chaque soupape correspondant. REMARQUE: L&#39;icône de la vanne doit devenir vert quand il est activé. Cliquez sur l&#39;icône active désactiver et fermer la vanne. L&#39;icône de la vanne fermée devrait devenir gris. </li><li> Ouvrez la vanne du réservoir DPBS (c.-à-., la solution de lavage) pour amorcer la vitesse d&#39;écoulement stable nécessaire à la cellule de piégeage de génération de vortex pendant 1,5 min. </li><li> Mettre l&#39;orifice de solution active à partir de la solution de lavage à la solution de cellules à piéger les cellules dans la chambre d&#39;électroporation de 30 secondes (à savoir, l&#39;étape de piégeage de cellule). </li><li> Circuler dans les deux solutions de lavage et de cellule à travers le dispositif pendant 10 secondes à la fois, avant l&#39;étape de piégeage de cellule à assurer un écoulement sans perturbation pendant l&#39;étape de mise en solution. REMARQUE: Cette étape co-courant bref doit être répété à chaque étape de solution de commutation. </li><li> Tournez sur le port de lavage et rincer l&#39;appareil pendant 20 secondes afin d&#39;éliminer les cellules contaminantes non piégés. </li><li> Injecter la solution contenant la première molécule d&#39;intérêt (0,2 mg / ml de 3.000 Da molécules de dextran neutre et anionique ou 1,5 mg / ml de 70 000 Da neutre molécule de dextran) dans le dispositif. </li><li> Appliquer cinq impulsions courtes (At = 30 ms avec 2 secondes d&#39;intervalle) rapidement après l&#39;injection de lasolution moléculaire et contrôler l&#39;amplitude et la durée des impulsions électriques appliquées en temps réel à l&#39;aide d&#39;un oscilloscope. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.10 autant de fois que le nombre de molécules supplémentaires pour être livré. Pour chaque livraison moléculaire, incuber les cellules pour 100 s dans la solution moléculaire puis rincer l&#39;appareil avec la solution de lavage pour 100 s pour éliminer les molécules excédentaires. </li><li> Libérer les cellules dans une plaque à 96 puits pour l&#39;analyse en aval en réduisant la pression de fonctionnement inférieure à 5 psi. REMARQUE: Environ 100 pi de solution avec 100 cellules est prélevé sur chaque version. </li><li> Exécutez l&#39;expérimental étapes 3.9 par 3.16 trois fois de recueillir suffisamment de cellules pour la cytométrie de flux. </li><li> Centrifuger la plaque de 96 puits contenant des cellules traitées pendant 5 min à 228 x g. </li><li> Eliminer le surnageant qui contient des molécules fluorescentes excès. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans du DPBS pour cytométrie de flux. </li><li> Les cellules de charge dans le cytomètre de flux pour u moléculaireptake analyse de l&#39;efficacité. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Avec la nouvelle plate-forme d&#39;électroporation parallélisée, l&#39;amélioration de 10 fois le débit et l&#39;efficacité de la livraison multi-molécule qui a été accompli en plus de tous les avantages que le système unique de la chambre précédemment développé fournit. 18 mérite Auparavant disponibles incluent (i) pré-purification de des cellules cibles avec une distribution uniforme de la taille de l&#39;amélioration de la viabilité, (ii) un contrôle précis et dosage individuel molécul...

Au cours des dernières années, l&#39;utilisation d&#39;impulsions électriques pour faciliter la délivrance cytosolique des molécules extracellulaires est devenue un moyen attrayant de la manipulation de cellules de mammifères. 1 Ce processus, également appelé électroporation, perméabilise la membrane cellulaire de façon réversible, ce qui permet de façon inhérente des molécules membranaires imperméables à accéder au milieu intracellulaire des cellules. Étant donné que pratiquement n&#39;importe quelle molécule peut être introduit dans le cytosol par les pores créés temporaires dans la membrane de n&#39;importe quel type de cellules en utilisant l&#39;électroporation, la technique a été rapporté comme étant plus reproductible, universellement applicable, et plus efficace que d&#39;autres méthodes, y compris le virus à médiation chimique et les approches optiques 3.2. Cette technique a été utilisée pour introduire des molécules fluorescentes, quatre médicaments et des acides nucléiques 5 7.6 tout en conservant les cellules intactes et viables. Compte tenu de ces avantages, l&#39;électroporation a été adopté comme un travail communtoire technique de l&#39;ADN pour la transfection in vivo du gène thérapeutique et huit études de vaccination cellulaire. Il est cependant toujours difficile pour les systèmes classiques d&#39;électroporation pour réaliser simultanément l&#39;efficacité pratique et la viabilité des échantillons avec une grande hétérogénéité de taille car l&#39;intensité du champ électrique nécessaire pour l&#39;électroporation est en étroite corrélation avec succès le diamètre de la cellule. En outre, ces systèmes ne permettent pas un contrôle précis des quantités moléculaires multiples livré à cause du besoin en vrac processus moléculaire stochastique de livraison. 9 Afin de répondre à ces questions, de nombreux groupes ont développé des plates-formes d&#39;électroporation microfluidiques, offrant l&#39;avantage de tensions de poration inférieurs, meilleure efficacité de la transfection, une réduction importante de la mortalité cellulaire, et la capacité de fournir de multiples molécules. 10-13 Ces avantages ont été rendus possibles grâce aux petites empreintes de systèmes d&#39;électroporation à micro-électrode dont la hauteurlongueurs sont des sous-millimètres, ce qui diminue considérablement les tensions nécessaires à la livraison réussie. De plus, ces systèmes à micro-électroporation peut obtenir une répartition uniforme du champ électrique et rapidement se dissiper la chaleur générée, ce qui donne une réduction de la mortalité cellulaire, tout en améliorant l&#39;efficacité d&#39;administration. L&#39;utilisation de matériaux transparents pour ces puces électroniques supplémentaires permettant l&#39;observation in situ du procédé d&#39;électroporation pour des modifications de paramètres d&#39;invite. 2,12 Toutefois, le contrôle du dosage précis et un contrôle de paramètres molecular- et cellulaire dépendante, nécessaires à la recherche et des applications thérapeutiques, 6 émergente, 14-16 restent encore en suspens. Ce travail présente un système microfluidique d&#39;électroporation assistée vortex, capable de délivrer de manière séquentielle de multiples molécules dans une population identique pré-sélectionnée de cellules cibles. Les cellules dont la distribution de taille uniforme sont isolés avant l&#39;électroporation en utilisant si antérieurementMécanisme de ze-sélectif piégeage. 17-18 En ayant une distribution uniforme de la taille, moins la variation de l&#39;efficacité de l&#39;électroporation et la viabilité accrue par la force du champ électrique donné ont été obtenues. 19 En outre, l&#39;agitation continue des cellules piégées à l&#39;aide de tourbillons microscopique a permis de distribution uniforme de molécules à travers la toute cytosol, en accord avec les résultats précédemment déclaré utiliser une autre plate-forme d&#39;électroporation assisté vortex. 20 Pour démontrer que ce système serait applicable à un large éventail de molécules couramment utilisées dans les applications biologiques, macromolécules avec une large gamme de poids moléculaires ont été livrés à cellules de cancer du sein métastatique. En outre, à l&#39;aide de la surveillance des processus en temps réel, ce travail fournit plus de preuves pour mettre fin au débat de longue date en ce qui concerne le mécanisme de livraison moléculaire au cours electrporation, étant essentiellement électrophorèse médiée par rapport à la diffusion médiation. 14 </sup&gt; Contrairement à d&#39;autres systèmes d&#39;électroporation, cette plate-forme permet de façon unique les avantages combinés de la distribution précise de plusieurs molécule, une haute efficacité de distribution moléculaire, la mortalité cellulaire minimal, pour une vaste gamme de dimensions et charges de molécules délivrées, ainsi que la visualisation en temps réel de l&#39;électroporation processus. Compte tenu de ces capacités, le système d&#39;électroporation développé a un potentiel pratique comme un outil polyvalent pour les études de reprogrammation cellulaire, les applications d&#39;administration de médicaments 6,14,21-22 10,19 et pour les applications nécessitant une compréhension en profondeur des mécanismes de prestation moléculaires d&#39;électroporation.

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		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:475px;">MDA-MB-231 cancer cell line</td>
			<td style="width:297px;">American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td style="width:119px;">HTB-26</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Leibovitz&#8217;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">10-045-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:475px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Trypsin</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Flow Cytometer easyCyte HT</td>
			<td style="width:297px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">0500-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Oxygen Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:297px;">Technics Micro-RIE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dektak 6M surface profiler</td>
			<td style="width:297px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">KMPR 1050</td>
			<td style="width:297px;">Microchem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Nitrogen gas</td>
			<td style="width:297px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">High Pressure Regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td>6162K22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Downstream regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">4000K563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">high-speed 3/2way-8 valve manifold</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Inline Check Valve</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">CV3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">5/32&#34; OD x 3/32&#34;ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td>PU-156F-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/4&#34; OD X 0.17&#34; ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td style="width:119px;">PU-250PB-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/16&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;">P1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/32&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">PEEK tubing unions</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Pulse Generator</td>
			<td style="width:297px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">8110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Aluiminum Wire</td>
			<td style="width:297px;">Bob Martin Company</td>
			<td style="width:119px;">6061 ALUM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">oscilloscope</td>
			<td style="width:297px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSO3062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">T75 culture flask</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3329</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

L&#39;électroporation a reçu une attention croissante au cours des dernières années, car il s&#39;agit d&#39;une technique très puissante pour l&#39;introduction de sondes moléculaires exogènes physiquement non par pénétration dans les cellules. Ce travail présente la plate-forme d&#39;électroporation microfluidique capable d&#39;effectuer la livraison de molécule multiple de cellules de mammifères avec contrôle des paramètres précis et moléculaire dépendant. La capacité du système à isoler les cellules avec une distribution uniforme de la taille permet une moindre variation de l&#39;efficacité d&#39;électroporation par l&#39;intensité du champ électrique donné; donc amélioré viabilité de l&#39;échantillon. Par ailleurs, sa fonction de visualisation de processus permet l&#39;observation du processus d&#39;absorption moléculaire fluorescent en temps réel, ce qui permet des ajustements de paramètres moléculaires rapides de délivrance in situ pour l&#39;amélioration de l&#39;efficacité. Pour montrer les vastes capacités de la plate-forme signalé, macromolécules de différentes tailles et des charges électriques (par exemple, Dextran avec MW de 3000 et 70 000 Da) étaientdélivré à des cellules de cancer du sein métastatique avec des rendements élevés de distribution (&gt; 70%) pour toutes les molécules testées. La plate-forme développée a prouvé son potentiel d&#39;utilisation dans l&#39;expansion des domaines de recherche où sur puce techniques d&#39;électroporation peuvent être bénéfiques.

Le électroporateur microfluidique parallèle développé livré macromolécules avec des tailles variées et des charges électriques dans les cellules de cancer du sein métastatique vivre. Livraison réussie moléculaire a été déterminée qualitativement par des changements dans l&#39;intensité de fluorescence des cellules par électroporation en orbite autour de la surveillance in situ et confirmée par des mesures quantitatives par analyse de cytométrie en flux. Figure 4A montre que 9...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Un tourbillon microfluidique plate-forme d&#39;électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l&#39;étape de purification de la cellule cible de l&#39;électroporation précédentes du système aidé à améliorer l&#39;efficacité d&#39;administration moléculaire et la viabilité des cellules traitées.

Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K vues.  Harvard University.  Un tourbillon microfluidique plate-forme d'électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l'étape de purification de la cellule cible de l'électroporation précédentes du système aidé à améliorer l'efficacité d'administration moléculaire et la viabilité des cellules trait...

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Recherche

Bio-ingénierie

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Peau tatouage comme une nouvelle approche pour la livraison des vaccins ADN

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

L&#39;utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l&#39;imagerie moléculaire multimodale Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

Mésenchymateuses stromales Culture cellulaire et livraison dans des conditions autologues: Une approche intelligente pour les applications orthopédiques

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Analyse de la ToT quadridimensionnelle à l'aide de l'enregistrement 3D-3D séquentiel

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...