This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.

1. 디자인 및 MDF 칩의 제조 <ol><li> 이나 AutoCAD와 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 개별 아크릴 층 패턴을 그리고 패턴을 저장합니다. <ol><li> 도 1A에서 4 층 아크릴 시트 패턴의 설계를 검토하고 층간 접속을 확인한다. </li></ol></li><li> 모든 아크릴 시트 및 CO 2 레이저 스 크라이 빙 (도 1B, 2A, 및 2B)를 이용하여 레이저 어블 레이션에 의해 양면 테이프를 제작한다. (16) <ol><li> 레이저 스크 라이버를 켜고 제어 노트북 컴퓨터를 연결합니다. </li><li> 상용 소프트웨어를 실행하고 클릭하여 단계 1.1 설계 패턴을 열고 &quot;디자인 패턴 파일을.&quot; </li><li> 레이저 스크 라이버의 XYZ 스테이지에 빈 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 조각을 놓습니다. </li><li> 자동 alignmen와 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저 빔의 초점을 설정레이저 스크 라이버의 제조업체에서 제공하는 T 스틱. </li><li> 아크릴 시트 또는 양면 테이프를 직접 가공에 레이저 스크 라이버에 디자인 패턴을 보냅니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 아크릴 시트에서 보호 종이를 제거하고 질소 가스로 깨끗한 표면을 날려. </li><li> 아크릴 시트를 스택 (110)에서 45 분 동안 열 본더에 2kg / ㎠의 압력 하에서 이들을 접합 흐름 / 전기 자극 채널 조립체를 형성하기 위해 C를 °. </li><li> 칩의 세포 배양 용 기재로서 현미경 용 커버 유리를 준비한다. <ol><li> 염색 항아리에 커버 유리를 넣고 재료 목록에 세제를 10 배 희석 항아리를 채우십시오. </li><li> 초음파 steri 청소기의 커버 유리와 염색 항아리를 넣고 15 분 동안 커버 유리를 청소하십시오. </li><li> , 염색 항아리에서 희석 한 세제를 붓고 증류수로 항아리를 보충하고, 단계 1.5를 반복합니다.2 3 회. </li><li> 양면 테이프로 부착하기 전에 질소 가스를 불어 넣어 세정 커버 유리를 건조. </li></ol></li><li> 단계 1.2 패터닝 양면 테이프 흐름 / 전기 자극 채널 어셈블리 세정 커버 유리를 부착. </li><li> 슈퍼 접착제와 MDF 칩 어셈블리의 제 1 층에 개별로 개구 아크릴 어댑터 (13)의 부착 편. MDF 칩 조립체는 완전한 (도 2d)이다. </li><li> 사용하기 전에 UV 조사 30 분으로 완료 MDF 칩 어셈블리를 멸균. </li></ol> MDF 칩의 소금 브리지 네트워크 2. 설정 <ol><li> 사용 (121)에서 15 분의 유지 시간을 설정하여도 3b에 도시 된 모든 플라스틱 튜브, 손으로 조인 견과류 및 마이크로 원심 튜브 살균 종래 오토 클레이브에서 C를 °. </li><li> 매체 입구를 통해 MDF 칩 어셈블리에 불소 수지 튜브 (도 3B-I)을 연결및 출구 어댑터는도 1a에 도시. </li><li> 그림에 플라스틱 튜브를 매체 입구의 루어 테이퍼를 연결하고 콘센트 3B-나는 3 방향 마개에. </li><li> 3 ㎖ 주사기를 사용하여 CO 2 -equilibrated 인산염 완충 식염수 (PBS), 2.5 mL를 취하여 입구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 주사기를 연결한다. 출구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 빈 3 ㎖ 주사기를 연결한다. 두 주사기 따라서 MDF 칩을 통해 서로 연결되어있다. 참고 : (37)의 PBS를 품어 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 CO 2는 PBS를 -equilibrated 얻을 수있다. </li><li> 백색 고체를 손으로 조인 너트와 레이어 1 PMMA 시트에있는 파란색의 개구부 및 녹색 어댑터 (그림 1A)를 밀봉 (그림 3B-III). </li><li> CO 2 염다리 채널 배양 챔버를 채우기 설정 단계 2.4에 기재된 주사기에 PBS를 -equilibrated. 기피기포의 형성. </li><li> 이어서, CO 2 넣어 O / N 항온 배양 용의 37 ° C, 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 MDF 칩을 PBS가 함유 -equilibrated. 이는 양면 테이프에 용해 공기 챔버에 버블을 형성 할 수있다. </li><li> 두 개의 주사기를 사용하여 채널에서의 빠른 흐름에 의해 PBS 채널에서 거품을 얻어 플러시. 앞뒤로 필요 PBS 펌프. </li><li> 매체 배출관에 연결된 3 방향 스톱 콕을 통해 채널에서 PBS 드레인. </li><li> CO 2는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 -equilibrated 새로운 3 mL를 주사기를 사용하여, 2.5 mL를 취하여 (단계 3.5 참조), 및 새와 입구에 연결된 주사기를 교체한다. 매체 채널을 리필. </li><li> 염다리 네트워크의 제조. <ol><li> 일시적으로 고체 너트 (그림 3B-III) 녹색 어댑터 (그림 1A)를 제거하고 (&gt; 70 ° C) 아가로 오스에 소금 BRI를 뜨거운 3 %를 주입녹색 어댑터 (그림 1A)에있는 구멍을 통해 당선 총재 채널. 주 : 뜨거운 아가로 오스의 제조 : PBS 50ml에 아가로 오스 분말 1.5 g을 녹인다. 오토 클레이브에서 121 ℃에서 20 분의 유지 시간을 설정하여 살균. </li><li> 액체 염다리 채널의 길이의 3/4을 채우면 아가 주입 멈춘다. </li><li> 아가로 오스 주입 후 고체 너트를 (그림 3B-III) 나사에 의해 녹색 어댑터 (그림 1A)에 구멍을 밀봉합니다. </li><li> 반투명 튜브를 손으로 조인 너트 (그림 3B)과 푸른 어댑터 (그림 1A)에 고체 너트를 교체합니다. </li><li> 3 % 통 너트 (그림 3B-IV)에 아가로 오스 예열을로드합니다. </li><li> 전 통 너트로의 Ag / AgCl을 전극 (그림 3B-V) (그림 3B-IV)을 포함아가로 오스의 응고. </li></ol></li><li> 염다리 네트워크의 설정을 완료 한 후, 한 번에, 배양 챔버로 한 실을 CL1-5 폐암 세포를 주입. </li></ol> 3. 암 세포의 준비 및 Electrotactic 실험에 대한 설정 <ol><li> 폐암 세포주 CL1-5의 레귤러 배양. <ol><li> 37 75T 세포 배양 플라스크에서 완전 배지에서 교수 팬 Chyr 양, 17에서 얻은 배양 CL1-5 폐암 세포, 5 % CO 2 분위기에서 C를 °. 완전 배지는 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 구성된다. 하위 문화 세포마다 3-4일. electrotaxis 실험 수행에 사용되는 세포는 원본에서 25 미만의 통로이다. </li></ol></li><li> 기하 급수적으로 증가 CL1-5 세포에 0.25 % 트립신 버퍼 2 ㎖를 추가하고 37에서 2 분 동안 품어 세포 detachmen에 대한 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터티. </li><li> 10 % FBS DMEM 6 ml의 분리 처리를 종료하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리하여 세포. 이어서 배지를 버리고 PBS 5 ㎖과 세포 펠렛을 중지. </li><li> PBS에서 세포의 수를 계산. 이어서 RT에서 5 분 동안 300g에 1 × 106 세포를 원심 분리를 수행. </li><li> PBS를 폐기하십시오. 미리 예열 CO 2 -equilibrated DMEM으로 세포를 중단하고 1 × 106 세포 / ml가되도록 세포 밀도를 조절한다. 참고 : 37 완전한 매체를 품어 ° C CO 2를 얻기 -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 DMEM을 -equilibrated 5 %. </li></ol> 4. Electrotactic 실험에 대한 설정 <ol><li> MDF 칩의 출구에서, 칩에 셀 1 × 106 / mL의 0.3 mL로, 주사. </li><li> 세포 배양 인큐베이터에서 셀 시드 MDF 칩을 인큐베이션 (37 ℃ 설정 2-4 시간 동안 ° C와 5 % CO 2). </li><li> MDF 마이크로의 설정유체 시스템. <ol><li> 투명 인듐 주석 산화물 유리 (ITO) 위에 히터 MDF 마이크로 유체 시스템을 설치한다. MDF 칩과 ITO 유리 사이 클립핑 K 형 열전대를 가진 MDF 칩의 온도를 측정한다. 비례 적분 미분 (PID) 컨트롤러와 ITO 히터를 제어 할 수 있습니다. 37 MDF 미세 유체 시스템 배양 온도를 설정 PID 제어기와 C를 °. 주 : ITO 히터의 제조 및 세포 배양 물 가열 시스템의 설치 이전의 보고서에 기재되어있다 (18, 19). </li><li> 거꾸로 현미경에 컴퓨터 제어 XYZ 전동 무대에서 온도 조절 MDF 칩 어셈블리를 장착합니다. 전동 무대의 사용 단계 5.1에 설명되어 있습니다. 4 채널 주사기 펌프 유입구를 통해 챔버로 배양 완전 배지 펌프. </li></ol></li><li> 20 μL / hr의 유속 MDF 칩으로 완전 배지 펌프. 아웃에서 문화 폐기물(그림 3a에 &quot;쓰레기&quot;로 표시)의 microcentrifuge 튜브에 수집 할 수 있습니다. </li><li> MDF 칩에 37 ℃에서 또 다른 16 ~ 18 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 배지를 교체하기 위해 10 분 동안 20 μL / 분의 유속에서 각 배양 챔버로 각각 50, 25, 5, 0 μM 키나아제 억제제를 함유하는 배지를 펌프. 주 : 10.6 mg의 키나아제 억제제로 멸균 3 ㎖을 첨가하여 회합 단백질은 Rho 키나아제 억제제의 Y27632의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 10 % FBS DMEM 배지를 이용하여, 각각 50, 25, 5 μM로 10 mM의 원액을 희석. </li><li> 37 ℃에서 또 다른 60 분 동안 키나아제 억제제로 세포를 배양한다. / 시간 20 μL에 중간 유량을 설정합니다. 동일한 배양 온도를 사용하는 단계 및 이후에 상기 유량. </li><li> 칩의 Ag / AgCl을 통해 전극 MDF 칩에 DC 전원을 접속하는 전기 배선을 사용한다. </li><li> 직렬 I 전류계를 연결N 전기 회로. MDF 칩에 전류를 모니터링하는 전류계를 사용한다. </li><li> DC 전원을 켜고 V. 15 내지 19에 전원 전압을 조정하여 86.94 μA 전류를 전류계로 설정 주 : 옴의 법칙을 고려 I는 벌크 재료를 통해 흐르는 전류, 즉, electrotactic 챔버 내의 배양액이고, E = I / (ΣA의 EFF), σ (= 1.38 Ω -1 m - 1)이고 배양 배지 (0.07 mm 높이 × 3mm의 폭 = 0.21 mm 2) EFF의 전도도 electrotactic 챔버의 유효 단면적, 및 300 MV / mm를 생성하기 위해 필요한 전류 (I) 인 MDF 칩의 EF는 86.94 μA이다. </li></ol> 5. 수집 및 세포 이미지 분석 <ol><li> MATLAB GUI 프로그램을 사용하여 모터 단계를 제어 할 수 있습니다. microsco에 장착 된 MDF 미세 유체 시스템과PE, 전동 단계를 사용하여 관찰 영역에 칩을 이동합니다. </li><li> 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 기록 세포의 현미경 사진에 탑재. </li><li> 2 시간 동안 15 분 간격으로 4 배 대물 렌즈를 사용하여 미세한 이미지를 가져 가라. </li><li> 세포 이동의 분석. <ol><li> NIH ImageJ에 1.47 (V)를 실행 </li><li> 셀의 중심의 최종 위치로 초기부터 거리를 분석한다. </li><li> &quot;이미지 시퀀스&quot; &quot;파일&quot;→ &quot;가져 오기&quot;→로 이동하여 세포 이동 분석을위한 9 개의 이미지를 가져옵니다. 제 화상은 제로 시간의 결과이고, 마지막 이미지가 120 분의 결과이다. </li><li> → &quot;측정 설정&quot; &quot;분석&quot;에 가서 옆에있는 상자 &quot;무게 중심&quot;을 확인 </li><li> &quot;자유형 선택&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 첫 번째 이미지에서 선택된 셀의 에지를 도시한다. </li><li> &quot;편집&quot;로 이동 → </em&gt; &quot;선택&quot;→ &quot;관리자 추가&quot; </li><li> 아홉 번째 이미지로 이동하여 첫 번째 이미지에서 선택한 같은 셀의 가장자리를 묘사. 셀의 위치는 이미지 여덟째 제를 사용 추적 될 수있다. </li><li> → &quot;관리자 추가&quot; &quot;편집&quot;→ &quot;선택&quot;으로 이동 </li><li> 반복 90 ~ 100 세포에서 데이터를 수집하기 위해 5.4.5 5.4.9에 단계를 반복합니다. </li><li> 선택한 셀의 초기 및 최종 위치의 결과를 얻을 → &quot;측정&quot;을 &quot;분석&quot;로 이동합니다. 주 : 이동 속도는 시간 당 평균 기포 이동 길이로 정의된다. directedness는 (애노드로부터 캐소드로) dcEF의 벡터 및 최종 위치에 셀의 시작점에서 벡터 사이의 코사인 각도로 정의된다. directedness는 음극쪽으로 마이그레이션 셀의 양극쪽으로 마이그레이션 세포 -1과 +1. 무작위 마일의 그룹에 대한세포 격자, directedness 0 2 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 까다로 MDF 칩의 제 1 층 상에 아크릴 어댑터를 부착하는 과정을 발견 하였다. 슈퍼 접착제 단지 1 내지 2 μL의 응용 단단히 MDF 칩 상에 어댑터를 부착하기에 충분하다. 접착제의 큰 금액은 슈퍼 접착제 및 준수 실패의 불완전한 중합 결과. 아크릴 어댑터 단단히 MDF 칩에 부착 한 후, 마이크로 유체 시스템의 액체 누출이 거의 발생하지 않았다. 또한, 진공 챔버 내부의 O / N 항온 처리는 양면 테...

직류 전계 (dcEF) 아래에 애노드 또는 캐소드 측으로 이동 부착 세포의 거동 electrotaxis로 지칭된다. 셀 electrotactic 동작은 배아 발생, 신경 재생과 상처 치유에 중요한 역할을한다. 이러한 쥐 전립선 암 세포, (2) 유방암 세포, 3, 폐 선암 세포 4-8로서 1 종양 세포가인가 dcEF하에 electrotactic 이동을 보여 주었다 . 생리 EF는 샘 조직에서 측정되었다. 9,10- Electrotaxis 또한 그랜드 - 관련 종양 세포에서보고되었다. 2,3- 암세포의 electrotaxis가 전이 인자로 간주되고, 종합적. 11의 전기 안내 제어 dcEF 하에서 암 세포는 암 치료를위한 미래의 잠재적 접근 할 수있다. 그러나 오늘, electrotaxis의 상세한 분자 메커니즘은 논란이 남아있다. 따라서, INF의 조사암 세포의 이동에 대한 전기 자극의 luence 암 치료 전략의 개발을 촉진 할 수있다. 최근 바이오 마이크로 유체 장치는 시험 관내에서 12 화학적 구배, 전기 자극 (13) 및 4 전단력을 유동 세포 반응을 연구 제작되었다. (또한 아크릴로 알려진 PMMA), 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 또​​는 폴리 메틸 메타 크릴 레이트를 사용하여 바이오 미세 유체 소자의 제작이 성공적으로 실험의 실패율을 감소시켰다. 또한, 생물학적 인 피사체를 조사하기위한 시제품으로서 아크릴계 마이크로 유체 장치를 이용하여 PDMS 칩을 사용하는 것보다 간단하다. 아크릴계 장치의 각종 기능은 electrotaxis 연구 개발되어왔다. 그러나, 이전 디자인의 것도 동시에 electrotaxis 연구를 위해 세포에 다양한 화학 조건의 효과와 전기 분야를 테스트 할 수 없습니다. 따라서, 우리는 미세 유체 장치 MU 개발ltichannel 이중 전기 분야 (MDF) 칩 포함하는 4 개의 독립적 인 문화 채널과 하나의 칩에 8 개의 다른 실험 조건을. 처음 허우에 의해보고 된 아크릴 기반 MDF 칩, 등., 8은 전기 자극과 여러 화학적으로 고립 채널을 통합합니다. 이러한 화학적으로 절연 한 채널 실험에서 배양 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 채널에 dcEF은 전력 공급에 의해 생성된다. 두 개의 독립적 인 전기장인가 전계 강도 (EFS) 0 EFS 또 다른 하나는, 각각의 화학적으로 절연 채널에서 수행된다. 이러한 방식으로, 칩 나은 제어 공존 EF 화학적 자극을 제공한다. 또한, MDF 칩 내부 화학적 확산의 수치 시뮬레이션 결과는 전혀 교차 오염이 24 시간 후 실험 기간 사이에 채널이 발생하지 것을 나타낸다. (8) 데비 비교리 의해보고 세륨 등., 14 MDF 칩은 전기적으로 자극 된 세포의 생화학 적 분석을 위해 더 큰 허용 배양 공간을 제공한다. 또한, 칩의 MDF 큰 관찰 영역보다 세포는 시험에서 관찰 할 수 있으므로, 전기적으로 자극 된 세포의 이동 속도 나 directedness의 분석은 더 정확하다. 황 등. (4) 및 영 외. (15)에 의해보고 된 이전 연구의 단일 채널 칩 설계는 셀 또는 화학 물질의 한 타입이 테스트 될 수 있도록. 그러나, MDF 칩 electrotaxis 다양한 화학 물질의 영향뿐만 아니라, 다른 종류의 세포에 대한 전기 자극의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다. 즉, MDF 칩은 화학 선량 의존성 효율적인 학습을 허용한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM medium</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Basic Life</td>
			<td >BL2651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Y-27632 (hydrochloride)</td>
			<td >Cayman Chemical Co</td>
			<td >10005583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agarose</td>
			<td >LONZO, USA</td>
			<td >SeaKem LE AGAROSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>3 ml with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way stopcock</td>
			<td>Nipro</td>
			<td >with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMMA (acrylic)</td>
			<td >HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td >thickness 1mm, 2mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >acrylic adaptor</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td >1/4-28 port, 10x10x6 mm</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nut</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td >UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glass</td>
			<td >Deckgl&#228;ser, Germany</td>
			<td >24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-sided tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >PET 8018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >super glue</td>
			<td >3M</td>
			<td >Scotch Liquid Plus Super Glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon tube</td>
			<td >HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan</td>
			<td >UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING</td>
			<td>outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scienti&#64257;c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TFD4 detergent</td>
			<td >Franklab, France</td>
			<td >TFD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultrasonic steri cleaner</td>
			<td >LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo bonder</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 laser scriber</td>
			<td >LTT group, Taiwan</td>
			<td >ISL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >indium tin oxide glass (ITO glass)</td>
			<td >AimCore Technology Co., Ltd</td>
			<td >TN/STN, &#8806;10&#937;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >proportional-integral-derivative (PID) controller</td>
			<td>JETEC Electronics Co., Japen</td>
			<td >TTM-J40-R-AB,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-type thermocouple</td>
			<td >TECPEL</td>
			<td >TPK-02A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-channel syringe pump</td>
			<td >KdScientific, USA</td>
			<td >250P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DC power supply</td>
			<td >GWInstek, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-Y-Z motor stage</td>
			<td >TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >inverted microscope</td>
			<td >Olympus, Japan</td>
			<td >CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >digital SLR camera</td>
			<td >Canon, Japan</td>
			<td >60D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip

직류 전계 (dcEF) 아래 방향 세포 이동의 동작 electrotaxis로 지칭된다. 배아 개발, 세포 분화 및 상처 치유하는 동안 세포의 이동을 안내에 생리 dcEF의 중요한 역할은 많은 연구에서 입증되었다. electrotaxis 분석에 미세 유체 칩을 적용함으로써, 조사 과정을 단축하고, 실험 오차가 최소화된다. 최근, 마이크로 유체 장치는 고분자 물질 (예를 들면, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA, 아크릴) 또는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 넓게 전기 자극에 세포의 반응을 연구에 사용되었다 만들었다. 그러나, PDMS 소자를 제조하는 데 필요한 다수의 단계와는 달리, 칩 uidic FL 아크릴 마이크로 간단하고 신속한 구조 장치 시제품 및 생산 모두에 적합하다. 그러나보고 된 장치 중 어느 것도 동시 화학 및 DCE의 효율적인 연구를 촉진하지세포에 F 효과. 이 보고서에서, 우리는 우리의 디자인 및 폐암 세포에 화학적 및 전기 자극의 효과를 동시에 조사하는 아크릴계 멀티 듀얼 전계 (MDF) 칩의 제조를 설명한다. MDF 칩은 하나의 시험에서 전기 / 화학적 자극의 여덟 조합을 제공합니다. 이 칩은 크게 필요한 실험 시간을 단축뿐만 아니라 electrotaxis 연구의 정확성을 증가뿐만 아닙니다.

MDF 장치의 제조 및 조립 아크릴계 MDF 칩의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 네 아크릴 시트, 하나의 커버 유리, 아크릴 어댑터 (13), 양면 테이프의 조각이 완료 MDF 칩 (도 2D)의 조립에 사용 하였다. MDF 장치의 네 개의 독립 채널을 배양이있다. 그러나, 온 - 칩 염다리 네트워크는 칩의 여덟 부...

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Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

electrotaxis-studies-lung-cancer-cells-using-multichannel-dual

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K 조회수.  Academia Sinica. Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...