Il est essentiel de combiner efficacement l’efficacité de capture avec l’observation dynamique de l’image cellulaire vivante pour comprendre l’effet de l’interaction cellule-cellule sur les comportements cellulaires. Ce tube peut capturer très efficacement plusieurs cellules individuelles dans une chambre plus grande, et fournir une base de cultures suffisante, pour le suivi dynamique de multiples comportements d’interaction unicellules. Commencez par préparer l’appareil PDMS.
Placer un moule à gaufrettes dans le plat de pesage avec 100 microlitres de trichlorosilane dans un dessiciateur et appliquer un aspirateur pendant 15 minutes. Arrêtez le vide et salinisez le moule à gaufrettes dans le dessiccateur à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Mélanger la base PDMS et l’agent curatif PDMS à un rapport de dix pour un, puis verser un total de 20 grammes du mélange sur le moule à gaufrettes dans un plat de 15 centimètres.
Placer le plat de 15 centimètres dans un dessiccateur et appliquer un aspirateur pendant une minute et demie. Retirez ensuite le plat du dessicateur et éliminez les bulles d’air résiduelles dans le PDMS avec du gaz azoté. Guérir le PDMS en plaçant le plat dans un four à 65 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.
Une fois terminé, retirez la réplique PDMS du moule à gaufrettes et perforez une entrée de 1,5 millimètre et une prise de 0,5 millimètre sur le PDMS. Nettoyez la réplique PDMS et la surface de la glissière avec du ruban amovible. Traiter la surface avec du plasma d’oxygène.
Ensuite, alignez manuellement la réplique PDMS avec la diapositive et les mettre en contact les uns avec les autres. Laissez la glissière PDMS dans le four à 65 degrés Celsius pendant une journée. Le lendemain, immerger l’appareil PDMS dans un conteneur rempli de PBS.
Placez-le dans le dessiccateur et appliquez le vide pendant 15 minutes. Déplacez l’appareil sur un capot de culture cellulaire et stérilisez-le avec de la lumière UV pendant 30 minutes. Remplacez le tampon de l’appareil PDMS par un milieu et incubez-le à quatre degrés Celsius pendant une journée.
Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, enlever le milieu de culture et les laver doucement trois fois avec cinq millilitres de PBS. Ajouter un millilitre de milieu DMEM/F-12 contenant un colorant fluorescent micromolaire aux cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP, et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, laver délicatement les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS stérile, retirer le PBS, et ajouter deux millilitres de 0,25%Trypsin-EDTA.
Incuber les cellules pendant quatre minutes à température ambiante, puis tapoter doucement le plat de culture pour favoriser le décollement cellulaire. Ajouter quatre millilitres de milieu DMEM/F-12 pour disperser les cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP, transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger à 300 xg pendant trois minutes. Retirer le supernatant et suspendre délicatement la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu DMEM/F-12.
Préparez un millilitre de suspension cellulaire à une concentration de trois fois dix à cinq cellules par millilitre et gardez-le sur la glace pour empêcher l’agrégation cellulaire. Connectez le tube de polytétrafluoroéthylène entre la sortie de l’appareil et la pompe à seringues. Retirez le milieu et ajoutez un microlitre de la suspension cellulaire préparée dans l’entrée de l’appareil PDMS.
Ensuite, chargez la suspension cellulaire dans l’appareil à l’aide d’une pompe à seringues à un débit de 0,3 microlitres par minute. Ajouter un microlitre de milieu DMEM/F-12 dans l’entrée de l’appareil, puis charger le milieu dans l’appareil à l’aide d’une pompe à seringues. Chargez 0,3 microlitres de milieu DMEM/F12 dans l’appareil avec la pompe à seringues à un débit de 10 microlitres par minute.
Une fois les cellules chargées, retirez le tube et scellez l’entrée et la sortie avec du ruban polyolefin pour créer un système de culture fermé. Déplacez l’appareil PDMS dans un plat de culture de 10 centimètres et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu. Transférer le plat de culture dans un incubateur pour une triple culture unicelliste.
L’appareil PDMS a une structure à trois couches avec un site de capture qui se connecte à la chambre de culture et au canal de dérivation. La différence de résistance au débit entre la chambre de culture et le canal de dérivation permet à la cellule de s’écouler dans la position de capture, ce qui fait passer la cellule suivante par le canal de dérivation jusqu’au site de capture suivant. L’étape de reflux est utilisée pour libérer la cellule du site de capture et l’envoyer dans la chambre de culture.
L’efficacité de capture cellulaire de ce protocole a été évaluée sur trois types de cellules différents. Cellules endothéliales lymphatiques humaines, ou LECs, carcinome squameux oral humain de cellules T2.6 cellules exprimant WNT5B-spécifique ARN court d’épingle à cheveux, et cellules de contrôle vectorielle pLKO-GFP. L’efficacité de capture à cellule unique des trois cellules démontrées était d’environ 71 % pour les LEC, de 74 % pour les cellules WNT5B sh4 et de 78 % pour les cellules pLKO-GFP.
L’efficacité triple de capture d’une seule cellule était de 48%Cette méthode peut être utilisée pour plusieurs co-cultures unicellules de cellules endothéliales lymphatiques et de cellules cancéreuses squameuses, et la prolifération et la morphologie de la cellule peuvent être observées au microscope. Il est important de s’assurer que les suspensions cellulaires préparées ont un minimum d’agrégats cellulaires, parce que les agrégats cellulaires réduisent non seulement l’efficacité de l’appariement unique, mais peuvent également obstruer les canaux micro. L’interaction cellule-cellule entre les cellules individuelles joue un rôle important dans le contrôle des comportements cellulaires.
Notre méthode peut fournir un outil efficace pour aider les chercheurs à étudier l’interaction cellule-cellule à un seul niveau cellulaire, ce qui peut conduire à la découverte de nouveaux mécanismes qui ne peuvent pas être facilement obtenus à partir d’études basées sur la population.
