This work was supported in part by the National Institutes of Health (P41-EB015903, R21EY023043, K25EB015885), National Science of Foundation (CBET-0853773) and Human Frontier Science Program (Young Investigator Grant).

Note: l&#39;analyse spectrale Brillouin nécessite un laser monomode longitudinal (~ 10 mW à l&#39;échantillon). À des fins d&#39;alignement, en utilisant une portion fortement atténuée de ce faisceau laser (&lt;0,1 mW). 1. Configuration initiale de fibres et de l&#39;EMCCD (Electron Charge Coupled Device Multiplié) Caméra <ol><li> Identifier environ 1600 mm d&#39;espace libre d&#39;alignement pour le spectromètre sur une table optique. </li><li> Monter la caméra EMCCD à la fin de l&#39;espace libre d&#39;alignement. <ol><li> Utilisez les vis de réglage pour fixer la caméra à des postes. Serrer les messages dans les titulaires de poste à la hauteur de l&#39;axe optique désirée. Serrer les titulaires des postes sur la table optique en utilisant des pinces de table. </li></ol></li><li> Allumez la caméra EMCCD. Soyez attentif pour éviter la saturation de la caméra. <ol><li> Installez le logiciel de l&#39;appareil photo sur l&#39;ordinateur de laboratoire et connecter l&#39;appareil photo à l&#39;ordinateur. </li><li> Désactiver le gain et mettre bas temps d&#39;intégration (~ 0,01 sec). Commencer à acquérir des images EMCCD. Observez l&#39;image de la caméras sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li></ol></li><li> Monter le collimateur de fibre autour de 1.600 mm à l&#39;avant de la caméra. <ol><li> Placez le collimateur de fibre dans l&#39;adaptateur de collimation de fibre. </li><li> Montez l&#39;adaptateur sur un poteau. Serrer le poste dans un support de poste à la hauteur approximative de l&#39;axe optique (hauteur de la caméra). Serrer titulaire du poste sur table optique en utilisant des pinces de table. </li></ol></li><li> Aligner le faisceau de sortie le long de l&#39;axe optique. <ol><li> Utilisez une vis de réglage pour connecter un iris standard pour un poste. Serrer le poste dans un support de poste. </li><li> Placer l&#39;iris en avant du collimateur de fibre (&lt;50 mm). Réglez la hauteur de l&#39;iris à la poutre. Déplacez l&#39;iris long de l&#39;axe optique désirée, qui doit pointer directement dans la caméra. </li><li> Insérer un filtre de densité optique directement après la sortie du laser si les acides gras saturés de la caméra. Les vis de réglage du collimateur de fibre de montage pour aligner le faisceau le long de l&#39;axe optique. Une fois que ceci est réalisé, lafaisceau sera proprement passer à travers l&#39;iris le long de la trajectoire du faisceau entier. </li></ol></li><li> Monter une paire de lentilles achromatique identifié (f = 30 mm) en face de la caméra. </li></ol> 2. Horizontal Stade de spectromètre <ol><li> Monter le masque horizontal. <ol><li> Utilisez les vis de réglage pour fixer le masque horizontale sur un poteau. Serrer le poste dans un support de poste. Monter le support sur un poste de phase de translation, ce qui permet de glisser le masque horizontalement dans et hors de la trajectoire du faisceau. (Figure 1) </li><li> Utilisez les vis pour serrer l&#39;étape de translation sur la table optique tels que le masque est fortement imagé sur la caméra CCD à la distance focale (f = 30 mm) de la paire de lentilles achromatiques. </li></ol></li><li> Monter et aligner la lentille sphérique S1 (f = 200 mm) de 600 mm à l&#39;avant du masque horizontale. <ol><li> Utilisez les vis de réglage pour monter S1 sur un titulaire du poste. Serrer le poste dans un support de poste. </li><li> Montez deux iris comme décrit dans 1.5.1. Avant placing S1 dans la trajectoire du faisceau, insérer un iris avant et une iris après la position désirée S1 (600 mm à l&#39;avant du masque horizontale). Régler la hauteur des iris de telle sorte que le faisceau passe à travers proprement deux d&#39;entre eux. </li><li> Placez S1 600 mm à l&#39;avant du masque horizontale (Figure 1). Ajustez la hauteur et l&#39;angle de S1 jusqu&#39;à ce que les deux, la réflexion marche arrière de la lentille et le faisceau sur-venir, passer proprement à travers les iris. Serrer le titulaire du poste tenant S1 sur la table optique en utilisant des pinces de table. </li></ol></li><li> VIPA2 mont dans le plan focal de la lentille sphérique (200 mm en avant de S1). <ol><li> Montez le support VIPA sur un poteau à l&#39;aide des vis fournies avec le support. Serrer le poste dans un support de poste. Serrer le titulaire du poste sur une platine de translation horizontale. (Figure 1) </li><li> Placez VIPA2 attentivement dans le support VIPA avec la fente d&#39;entrée orienté verticalement. (Figure 1) </li><li> Beaux-ajuster la position of monter le VIPA pour être exactement dans le plan focal de S1. (Vérifiez en traçant la taille du faisceau avec une carte blanche.) </li><li> Utilisez les vis pour serrer l&#39;étape de translation sur la table et glisser VIPA2 optique hors du faisceau en utilisant le degré de liberté de la scène de translation. </li></ol></li><li> Monter et aligner la lentille sphérique S2 (f = 200 mm) de 200 mm après la VIPA et 200 mm à l&#39;avant du masque horizontale. Suivez la procédure décrite dans 2.2.1-2.2.3. Au lieu de fixer le titulaire du poste sur la table optique, le monter sur une scène de translation avec son degré de liberté orienté le long de l&#39;axe optique. (Figure 1) Utilisez les vis pour serrer l&#39;étape de translation sur la table optique. </li><li> Utiliser l&#39;étage de translation horizontale (2.3.4) à l&#39;entrée de glisser VIPA2 dans le trajet du faisceau. Respecter les lignes verticales sur l&#39;image de la caméra. <ol><li> Beaux-S2 ajuster en utilisant l&#39;étape de translation monté dans 2.4 jusqu&#39;à ce que les lignes verticales sur l&#39;image de la caméra apparaissentpointu. </li></ol></li><li> Réglez le spectre avec le degré d&#39;inclinaison horizontale de la liberté sur le support VIPA et le stade de translation. Utilisez le degré de liberté horizontal traduction pour régler la position d&#39;entrée du faisceau dans l&#39;étalon. Utilisez le degré de liberté horizontal inclinaison pour ajuster l&#39;angle du faisceau d&#39;entrée dans l&#39;étalon. </li><li> Mesurer la finesse et le débit. <ol><li> Prenez une image en appuyant sur F5 ou bien en cliquant sur &quot;configuration de l&#39;acquisition» dans le coin supérieur gauche et en choisissant l&#39;option «prendre l&#39;image&quot; dans le logiciel de la caméra. </li><li> Faites un clic droit sur l&#39;image et choisissez l&#39;option &quot;de la parcelle de ligne&quot;. Faites glisser le curseur horizontalement sur l&#39;image pour générer un tracé de ligne. Relâchez le curseur pour observer le tracé de la ligne générée. </li><li> Utilisez le tracé de la ligne pour mesurer la finesse. Diviser la distance entre deux sommets par leur largeur à mi-hauteur (FWHM). Visez&gt; 30. </li><li> Déterminer le débit par measuring le pouvoir avec un compteur de puissance immédiatement avant et après VIPA2. Visez&gt; 50%. </li><li> Ajuster l&#39;angle d&#39;entrée du faisceau dans l&#39;étalon avec le degré de liberté sur le support VIPA (2,6) et observer le compromis entre finesse et le débit. </li></ol></li><li> Si la finesse et le débit ne sont pas satisfaisants revenir en arrière et fine ajuster l&#39;alignement. Assurez-vous que VIPA2 se trouve dans le plan focal de S1. Répétez les étapes 2.3.3 -2.7. </li></ol> 3. Vertical Stade de spectromètre <ol><li> Faites glisser le VIPA (VIPA2), aligné dans la partie 2, sur le faisceau en utilisant l&#39;étape de translation (2.3.4). La phase horizontale du spectromètre va maintenant se comporter comme un mélange 1: 1 d&#39;imagerie. </li><li> Monter le masque vertical. <ol><li> Utilisez les vis de réglage pour fixer le masque vertical sur un poste. Serrer un poste dans un adaptateur poste de pince à angle droit. Serrer un deuxième poste dans l&#39;adaptateur à angle droit et le mettre dans un titulaire du poste. Montez le titulaire du poste sur un vertical translationnelle étape, allowing du masque de coulisser verticalement dans et hors du trajet du faisceau. (Figure 1) </li><li> Utilisez des vis de chapeau à resserrer l&#39;étape de translation verticale sur la table optique tels que le masque vertical est imagé fortement sur la caméra EMCCD 200 mm à l&#39;avant du S1. </li></ol></li><li> Monter et aligner la lentille cylindrique C1 (f = 200 mm) 600 mm à l&#39;avant du masque vertical. <ol><li> Vissez le support de lentille cylindrique sur un poste. Serrer le poste dans un support de poste. Placez délicatement C1 dans le support de lentille et serrez les vis pour le fixer en place. </li><li> Montez deux iris comme décrit dans 1.5.1. Avant de placer C1 dans la trajectoire du faisceau, insérer un iris avant et une iris après la position désirée S1 (600 mm à l&#39;avant du masque vertical). Régler la hauteur des iris de telle sorte que le faisceau passe à travers proprement deux d&#39;entre eux. </li><li> Lieu C1 600 mm en avant du masque vertical (figure 1). Ajustez soigneusement la hauteur, l&#39;inclinaison et la position latérale de C1 jusqu&#39;àà la fois, la réflexion marche arrière de la lentille et le faisceau sur-venir, sont centrés sur les iris. Serrer le titulaire du poste maintien C1 sur la table optique en utilisant des pinces de table. </li></ol></li><li> VIPA1 mont dans le plan focal de la lentille cylindrique (200 mm en avant du C1). <ol><li> Montez le support VIPA sur un poteau à l&#39;aide de la vis fournie avec le support. Serrer le poste dans un support de poste. Serrer le titulaire du poste sur une platine de translation verticale. (Figure 1) </li><li> Placez VIPA1 attentivement dans le support VIPA avec la fente d&#39;entrée orienté horizontalement. (Figure 1) </li><li> Beaux-ajuster la position de la VIPA montage pour placer VIPA1 exactement dans le plan focal de C1. (Vérifiez en traçant la taille du faisceau avec une carte blanche.) </li><li> Utilisez des vis de chapeau à resserrer l&#39;étape de translation verticale sur la table optique et glissent VIPA1 hors du faisceau en utilisant le degré de liberté de la scène de translation. </li></ol></li><li> Monter et aligner lelentille cylindrique C2 (f = 200 mm) 200 mm après VIPA1 et 200 mm à l&#39;avant du masque vertical, suivant la procédure décrite dans 3.3.1-3.3.3. Au lieu de fixer le titulaire du poste sur la table optique, le monter sur une scène de translation avec son degré de liberté orienté le long de l&#39;axe optique. (Figure 1) Utilisez les vis pour serrer l&#39;étape de translation sur la table optique. </li><li> Utiliser l&#39;étage de translation (3.4.4) à l&#39;entrée de glisser VIPA1 dans le trajet du faisceau. Respecter les lignes horizontales sur l&#39;image de la caméra. <ol><li> Ajustez avec C2 en utilisant l&#39;étape de translation monté dans 3,5 jusqu&#39;à ce que les lignes horizontales sur l&#39;image de la caméra apparaissent forte. </li></ol></li><li> Réglez le spectre avec le degré d&#39;inclinaison verticale de la liberté sur le support VIPA et le stade de translation. Utilisez le degré de liberté vertical traduction pour régler la position d&#39;entrée du faisceau dans l&#39;étalon. Utilisez le degré de liberté vertical inclinaison pour ajuster l&#39;angle du faisceau d&#39;entrée dans l&#39;alsur. </li><li> Mesurer la finesse et le débit. <ol><li> Suivez les étapes 2.7.1 -2.7.2 pour générer un tracé de ligne verticalement à travers une image de l&#39;écran de l&#39;appareil. </li><li> Utilisez le tracé de la ligne pour mesurer la finesse en divisant la distance entre deux lignes horizontales par leur largeur à mi-hauteur (FWHM). Visez&gt; 40. </li><li> Mesurer le débit par mesure de la puissance avec un mesureur de puissance immédiatement avant et après VIPA1. Visez&gt; 30%. </li><li> Ajuster l&#39;angle d&#39;entrée verticale du faisceau dans l&#39;étalon avec le degré d&#39;inclinaison verticale de la liberté sur le support VIPA (3,7). Observez le compromis entre finesse et le débit. </li></ol></li><li> Si la finesse et le débit ne sont pas satisfaisants revenir en arrière et fine ajuster l&#39;alignement. Assurez-vous que VIPA1 est dans le plan focal de la C1. Répétez l&#39;étape 3.4.3-3.8. </li></ol> 4. Combinaison des deux étapes et l&#39;alignement final <ol><li> Glissez dans VIPA2. Respecter les points horizontalement et verticalement espacées. Ces points unere la signature spectrale du laser à fréquence unique. Réglez les étapes de translation des VIPAs jusqu&#39;à ce que les points sont au point. </li><li> Mesurer la finesse et le débit du spectromètre. <ol><li> Suivez les étapes 2.7.1.-2.7.2 pour générer un tracé de ligne diagonale à travers deux des points laser. </li><li> Utilisez le tracé de la ligne pour mesurer la finesse en divisant la distance en diagonale entre deux points par leur largeur à mi-hauteur (FWHM). Visez&gt; 30. </li></ol></li><li> Construire une boîte noire pour enfermer le spectromètre. <ol><li> Utilisation des rails de construction pour construire le squelette boîte, qui doit entourer la totalité du spectromètre de collimateur de fibre de la caméra CCD (63 in x 9 in x 15 in). </li><li> Couvrir la boîte squelette avec Blackout tissu et du ruban adhésif étanche dans les coins. Veiller à ce que les masques et les VIPAs sont facilement accessibles. </li></ol></li><li> Se connecter la fibre optique à une sonde standard, tel qu&#39;un microscope confocal réflectance 4. P optique standardrobes utilisés pour collecter la lumière diffusée en retour porteront un signal de Brillouin. </li></ol> 5. mesure du décalage Brillouin <ol><li> Fermer la fois le vertical et l&#39;horizontal masques jusqu&#39;à la signature laser disparaît. Déplacez les stades de la traduction en conséquence. </li><li> Activer le gain et augmenter le temps d&#39;intégration de la caméra, autant que possible sans saturer la caméra EMCCD. </li><li> Observez le changement de Brillouin d&#39;un échantillon. <ol><li> Placer un échantillon dans la mise au point d&#39;un microscope confocal (ou une autre sonde optique). La résolution spatiale dépend de la lentille d&#39;objectif utilisée dans le microscope confocal. Utilisez un plat en plastique ou une cuvette pour les liquides. Utilisation du methanol pour la première mesure. </li></ol></li><li> Pour optimiser le débit du spectromètre, ouvert un masque à la fois et parcourir les ordres du spectromètre en inclinant le VIPA et en ajustant sa phase de traduction. Trouver l&#39;ordre dans lequel apparaît le signal le plus fort. Fermer masque nouveau jusqu&#39;à ce que esignal laser e disparaît. Répéter l&#39;opération avec l&#39;autre masque et VIPA (décrit dans 2.6 et 3.7). </li><li> Prendre une mesure de l&#39;échantillon. <ol><li> Prenez une image du spectre après l&#39;étape 2.7.1. </li><li> Obtenir des mesures d&#39;étalonnage en prenant une image du spectre de l&#39;eau et le verre (ou autre échantillon avec connue changement de Brillouin). Enregistrez l&#39;image en cliquant sur «Fichier» dans le coin supérieur gauche et en choisissant l&#39;option &quot;enregistrer sous&quot;. Enregistrer l&#39;image en format &quot;.sif&quot; si l&#39;analyse des données est effectuée dans le logiciel de la caméra. Enregistrez l&#39;image en format &quot;.tif&quot; si l&#39;analyse des données est effectuée dans un autre logiciel de calcul. </li></ol></li></ol> 6. étalonnage et d&#39;analyse du spectre Brillouin <ol><li> Déterminer la gamme spectral libre (FSR) et le EMCCD pixel optique ratio de conversion de fréquence (PR) dans le spectromètre de Brillouin. <ol><li> Charger les données dans le logiciel de la caméra ou un autre Computalogiciel tional. </li><li> Suivez l&#39;étape 2.7.2 pour générer un tracé de ligne à travers le spectre de l&#39;image d&#39;étalonnage de l&#39;eau. </li><li> Monter les deux pics du spectre avec des courbes de Lorentz pour déterminer les positions de pointe en termes de position de pixel (P eau-S, P Eau-AS). Alternativement, lire les positions des pics manuellement en prenant le point sur les sommets les plus élevés. </li><li> Répétez l&#39;étape 6.1.2-6.1.3 avec le spectre de l&#39;image d&#39;étalonnage de verre. </li><li> Alternativement à 6.1.1-6.1.4, ajouter les deux cadres EMCCD et monter tous les quatre sommets à la fois. (Figure 2) </li><li> Calculer la PR en utilisant l&#39;équation 1. Branchez les valeurs de P eau-AS et P Glass-déterminée 6.1.3 et 6.1.4. Verre Ω-AS est connu pour être de 29,3 GHz. Dans ce cas, puisque la gamme spectrale libre est à seulement 20 GHz, il apparaîtra alias avec le décalage de fréquence de 9,3 GHz. Pour plus de simplicité utiliser 9,3 GHz pour Ω Glass-AS. Utilisez 7.46 GHz pour ΩEau-AS. <img alt="Equation 1" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq1.jpg" /></li><li> Calculer la FSR en utilisant l&#39;équation 2. Branchez les valeurs P verre-S, P Glass-AS et PR, calculées 6.16. Utilisez 9,3 GHz pour Ω Glass-AS. <img alt="Equation 2" class="jove_content" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq2.jpg" /></li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="jove_content" src="/files/ftp_upload/53468/53468fig2.jpg" /> Figure 2. calibration du spectromètre. Cadre (A) de la caméra EMCCD obtenu à partir de l&#39;échantillon d&#39;étalonnage. (B) courbe d&#39;ajustement de Lorentz (rouge) pour les données mesurées (en bleu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53468/53468fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="2"><li> Déterminer le décalage Brillouin deun échantillon. <ol><li> Suivez l&#39;étape 2.7.2 pour générer un balayage de ligne à travers le spectre de l&#39;échantillon. </li><li> Monter les deux pics du spectre avec des courbes de Lorentz pour déterminer les positions de pointe en termes de position de pixel. Alternativement, lire les positions des pics manuellement en prenant le point sur les sommets les plus élevés. </li><li> Utilisez les équations suivantes 4 et 5 et les valeurs précédemment calculées pour FSR et PR pour calculer le déplacement de Brillouin de l&#39;échantillon. <img alt="Équation 3" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

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	<li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+de+la+lumiere+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homogene;+influence+del'agitation+thermique.">Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique.</a> Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy.">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li><li>Scarcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Brillouin+microscopy+for+three-dimensional+mechanical+imaging.">Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging.</a> Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).</li><li>Nichols, A. J., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+Scanning+Confocal+Microscopy+and+Microendoscopy.">Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy.</a> J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).</li><li>Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brillouin+spectroscopy+as+a+new+method+of+screening+for+increased+CSF+total+protein+during+bacterial+meningitis.">Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis.</a> J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).</li><li>Koski, K. J., Yarger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brillouin+imaging.">Brillouin imaging.</a> Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).</li><li>Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. 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Giuliano Scarcelli and Seok H. Yun hold patents related to Brillouin spectroscopy technology.

Une des principales caractéristiques de la conception de cette configuration de spectromètre est que les deux étapes peuvent être alignés de façon indépendante. Quand un étalon VIPA est glissé hors du trajet optique, les lentilles restantes de la phase de spectromètre forment un mélange 1: 1 d&#39;imagerie, de sorte que le motif spectral de chaque étage est imagée sur la caméra CCD. Par conséquent, il est facile de revenir à l&#39;une des étapes pour améliorer ses performances sans affecter l&#39;align...

Diffusion Brillouin, d&#39;abord décrit par Léon Brillouin 1 en 1922, est la diffusion inélastique de la lumière à partir des modes acoustiques thermiques dans un solide et des fluctuations de densité thermique dans un liquide ou un gaz. Le décalage spectral de la lumière diffusée, généralement dans la sous-gamme GHz, fournit des informations sur l&#39;interaction entre la lumière incidente et les phonons acoustiques dans l&#39;échantillon. En conséquence, il peut fournir des informations utiles en ce qui concerne les propriétés viscoélastiques du matériau examiné. Dans sa version spontané, la diffusion Brillouin a généralement des sections transversales de l&#39;ordre de la diffusion Raman, résultant en un signal très faible. En outre, les changements de fréquence de Brillouin sont des ordres de grandeur plus faible que les changements Raman. En conséquence, élastique lumière diffusée (de Rayleigh ou la diffusion de Mie), la lumière parasite et de back-off réflexions de l&#39;échantillon peuvent tous facilement éclipser la signature spectrale Brillouin. Par conséquent, Un spectromètre de Brillouin a besoin non seulement d&#39;obtenir des sous-GHz résolution spectrale mais aussi contraste spectral haute ou l&#39;extinction. Dans spectromètres de Brillouin traditionnels, ces exigences sont remplies par monochromateurs de balayage-réseau, les méthodes de battage optiques, et, plus couramment, interféromètres numérisation multiple-pass Fabry-Perot 2. Ces méthodes mesurent chaque composante spectrale séquentiellement. Cette approche conduit à des temps d&#39;acquisition pour un unique spectre de Brillouin allant de quelques minutes à plusieurs heures, en fonction de l&#39;instrument et sur l&#39;échantillon. Le VIPA spectromètre à deux étages, construit en utilisant ce protocole, a la capacité de rassembler tous les composants spectraux en moins d&#39;une seconde, tout en offrant l&#39;extinction suffisante (&gt; 60 dB) pour supprimer efficacement les autres signaux parasites 2. L&#39;intégration des étalons VIPA est l&#39;élément clé de ce spectromètre. Un VIPA est un étalon solide avec trois c différentezones flottantes: dans la surface avant, une bande de revêtement anti-reflet étroite permet à la lumière d&#39;entrer dans le VIPA, tandis que le reste de la surface dispose d&#39;un (HR) revêtement hautement réfléchissant; dans la surface arrière, un revêtement partiellement réfléchissant permet à une petite partie (environ 5%) de la lumière à transmettre. Lorsque focalisé sur l&#39;entrée étroite de la VIPA légèrement incliné, le faisceau de lumière se réfléchit en sous-composants avec différence de phase fixe dans le VIPA 2. Les interférences entre les sous-composantes réalise la dispersion spectrale élevée aspiré. Aligner deux VIPAs séquentiellement en configuration axe transversal introduit dispersion spectrale dans des directions orthogonales 3. La dispersion spectrale dans des directions orthogonales dans l&#39;espace séparant les pics de Brillouin de la diaphonie indésirable, ce qui rend possible de récupérer uniquement le signal de Brillouin. La figure 1 présente un schéma de la VIPA spectromètre à deux étages. Les flèches ci-dessous les éléments optiques indiquent les degree de liberté dans lequel doivent être orientés les stades traductionnelles. <img alt="Figure 1" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468fig1.jpg" /> Figure 1. configuration instrumentale. Une fibre optique offre la diffusion Brillouin dans le spectromètre. Une lentille cylindrique C1 (f = 200 mm) focalise la lumière dans l&#39;entrée de la première VIPA (VIPA1). Une autre lentille cylindrique C2 (f = 200 mm) mappe la dispersion angulaire spectrale en une séparation spatiale dans le plan focal de C2. Dans ce plan, un masque vertical est utilisé pour sélectionner la partie souhaitée du spectre. Une configuration analogue suit, incliné à 90 degrés. Le faisceau passe à travers une lentille sphérique S1 (f = 200 mm) et se concentre dans la fente d&#39;entrée de la deuxième VIPA (VIPA2). Une lentille sphérique S2 (f = 200 mm) crée le motif bidimensionnel spectralement séparée dans son plan focal, où un autre masque horizontal est placé. L&#39;hormasque izontal est imagé sur la caméra EMCCD utilisant une paire de lentilles achromatiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53468/53468fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Un étudiant de premier cycle avec quelques cours de l&#39;optique et de l&#39;expérience de base d&#39;alignement devrait être en mesure de construire et d&#39;utiliser ce spectromètre à deux étages. Le spectromètre a été récemment montré pour être compatible avec une grande variété de sondes optiques standard 3,4,5 (par exemple, un microscope confocal, endoscope, la lampe à fente ophtalmoscope). Ici, le spectromètre est connecté à un microscope confocal. La lumière laser est aligné dans un système de recherche inversée microscope standard après avoir intégré un diviseur de faisceau 90:10. La lumière de rétrodiffusion à partir de l&#39;échantillon est couplé dans une fibre monomode, rendant le microscope confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTICS:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VIPA (virtual image phase array)</td>
			<td style="width:71px;">LIGH MACHINERY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td style="width:119px;">423-MIC&#160;</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>9066-X</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>SM-13</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Adjustable Width Slit</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>SV-0.5</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in.</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>DS40-Z</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slotted Base Plate, 25 or 40mm to 65mm Stage, 1.1 in. Range</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>B-2B</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4&#34;-20 Tap, L = 2&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>TR2-P5</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PH2-P5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PH3-P5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Imperial Lens Mount For 2&#34; Optics, 8-32 Tap</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>LMR2</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">f=200.0 mm, &#216;2&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>AC254-200-A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Kinematic Mount for up to 1.3&#34; (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>KM100C</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60&#34; (40.6 mm)</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>CH1A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">f = 200.00 mm, H = 30.00 mm, L = 32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>L1653L1-A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Right-Angle Post Clamp, Fixed 90&#176; Adapter</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Studded Pedestal Base Adapter, 1/4&#34;-20 Thread</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PB4</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spacer, 2&#34; x 3&#34;, 1.000&#34; Thick</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>Ba2S7</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg.</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>F260APC-A</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SM1-Threaded Adapter for &#216;11 mm collimators</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>Ad11F</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Translating Lens Mount for &#216;1&#34; Optics, 1 Retaining Ring Included</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>LM1XY</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>P3-460B-FC-2</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>MAP103030-A</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SM1 Lens Tube&#8230;length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SM1LXX</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Base Adapters for &#216;1/2&#34; Post Holders and &#216;1&#34; Posts</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>BE1</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clamping Forks for&#160; &#216;1/2&#34; Post Holders and &#216;1&#34; Posts</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>CF125</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series&#160;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>HW-KIT5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">D20S - Standard Iris, &#216;20.0 mm Max Aperture&#160;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>D20S</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FOR ENCLOSURE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 21&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L21</td>
			<td>Quantity: 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#34; Construction Cube with Three 1/4&#34; (M6) Counterbored Holes</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>RM1G</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25A90</td>
			<td>Quantity: 12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 15&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L15</td>
			<td>Quantity: 4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 9&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L09</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">High Performance Black Masking Tape, 2&#34; x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>T743-2.0</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-Profile T-Nut, 1/4&#34;-20 Tapped Hole, Qty: 10</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25T3</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#160;1/4&#34;-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box)</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SH25LP38</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">60&#34; (W) x 3 yds. (L) x 0.005&#34; (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>BK5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CAMERA,&#160; LASER and MICROSCOPE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:71px;">ANDOR</td>
			<td style="width:119px;">iXon Ultra 897</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">400 mW single mode green laser</td>
			<td style="width:71px;">LASER QUANTUM</td>
			<td style="width:119px;">torus 532</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Research Inverted System Microscope&#160;</td>
			<td style="width:71px;">OLYMPUS</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis

L&#39;objectif de ce protocole est de construire un haut-extinction parallèle et haute résolution Brillouin optique spectromètre. Spectroscopie de Brillouin est une méthode de mesure sans contact qui peut être utilisée pour obtenir des lectures directes des propriétés des matériaux visco-élastique. Il a été un outil utile dans la caractérisation des matériaux, la surveillance et la détection de l&#39;environnement structurel. Dans le passé, la spectroscopie de Brillouin est habituellement utilisé balayage étalons de Fabry-Pérot pour effectuer une analyse spectrale. Ce processus nécessite une puissance d&#39;éclairage élevée et temps d&#39;acquisition longues, ce qui rend la technique inadaptée pour des applications biomédicales. Un roman spectromètre récemment introduit surmonte ce défi en utilisant deux VIPAs dans une configuration axe transversal. Cette innovation permet (GHz) analyse spectrale de résolution de sous-Gigahertz avec un temps d&#39;acquisition inférieur à la seconde et de la puissance d&#39;éclairage dans les limites des tissus biologiques de sécurité. Les nouvelles de multiples applications facilitées par cette amélioration sont currently explorée dans la recherche biologique et l&#39;application clinique.

<html> La figure 3 montre les spectres de Brillouin représentatif et leurs accès pour les différents matériaux. Les VIPAs les deux ont une épaisseur de 5 mm ce qui entraîne une FSR de l&#39;ordre de 20 GHz. Le temps d&#39;intégration pour ces mesures était de 100 ms. 100 mesures ont été prises et une moyenne. Une mesure d&#39;étalonnage a été prise avant d&#39;acquérir les spectres. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/...

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High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Nous présentons ici un protocole pour construire un spectromètre de Brillouin rapide. Cascade réseau de phase virtuellement représenté (VIPA) étalons atteindre une vitesse de mesure plus de 1000 fois plus rapide que le balayage traditionnel spectromètres de Fabry-Perot. Cette amélioration fournit les moyens d&#39;analyse de Brillouin de tissu et des biomatériaux à de faibles niveaux de puissance in vivo.

High Speed ​​Sous-GHz spectromètre pour Brillouin Scattering Analyse

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

high-speed-sub-ghz-spectrometer-for-brillouin-scattering-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vues.  University of Maryland.  Nous présentons ici un protocole pour construire un spectromètre de Brillouin rapide. Cascade réseau de phase virtuellement représenté (VIPA) étalons atteindre une vitesse de mesure plus de 1000 fois plus rapide que le balayage traditionnel spectromètres de Fabry-Perot. Cette amélioration fournit les moyens d'analyse de Brillouin de tissu et des biomatériaux à de faibles niveaux de puissance in vivo. 

Vidéo: High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Préparation de la matrice extracellulaire des fibres de protéines pour Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Utilisation de la diffusion améliorée par Nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High Speed ​​Sous-GHz spectromètre pour Brillouin Scattering Analyse

High Speed Sous-GHz spectromètre pour Brillouin Scattering Analyse