This work was supported in part by the National Institutes of Health (P41-EB015903, R21EY023043, K25EB015885), National Science of Foundation (CBET-0853773) and Human Frontier Science Program (Young Investigator Grant).

Anmerkung: Brillouin Spektralanalyse erfordert eine Einzellängsmode-Laser (~ 10 mW bei der Probe). Zum Ausrichten Zwecke, mit einem stark abgeschwächten Teil dieses Laserstrahls (&lt;0,1 mW). 1. Initial Setup der Faser und der EMCCD (Electron Multiplizierte Charge Coupled Device) Kamera <ol><li> Identifizieren etwa 1.600 mm frei ausrichtenden Raum für das Spektrometer auf einem optischen Tisch. </li><li> Montieren Sie das EMCCD Kamera auf das Ende des freien Ausrichten Raum. <ol><li> Verwenden Stellschrauben, um die Kamera an Beiträge anhängen. Ziehen Sie die Beiträge in der Posthalter an der gewünschten Höhe der optischen Achse. Ziehen Sie die Fachbereichs auf die optische Tisch mit Tischklemmen. </li></ol></li><li> Schalten Sie das EMCCD Kamera. Denken Sie an die Kamera Sättigung zu vermeiden. <ol><li> Installieren Sie die Kamera-Software auf Laborcomputer und schließen Sie die Kamera an den Computer an. </li><li> Deaktivieren Sie die Verstärkung und stellen niedrigen Integrationszeit (~ 0.01 sec). Starten Sie den Erwerb EMCCD Bilder. Beobachten Sie das Kamerabilds auf dem Computerbildschirm. </li></ol></li><li> Montieren Sie den Faserkollimator ca. 1.600 mm vor der Kamera. <ol><li> Legen Sie die Faserkollimator im Faserkollimator Adapter. </li><li> Montieren Sie den Adapter auf einem Post. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter in der ungefähren Höhe der optischen Achse (Höhe der Kamera). Ziehen Posthalter auf optischen Tisch mit Tischklemmen. </li></ol></li><li> Ausrichten des Ausgangsstrahls entlang der optischen Achse. <ol><li> Verwenden Sie eine Stellschraube, um ein Standard-Blende an einem Pfosten zu verbinden. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. </li><li> Platzieren der Blende vor dem Faserkollimator (&lt;50 mm). Stellen Sie die Höhe der Iris, um den Strahl. Bewegen die Blende entlang der gewünschten optischen Achse, die direkt in der Kamera zeigen soll. </li><li> Legen Sie eine optische Dichte-Filter direkt nach der Laserausgangsleistung, wenn die Kamera in Sättigung. Mithilfe der Stellschrauben Faserkollimator montieren, um den Strahl entlang der optischen Achse auszurichten. Sobald dies erreicht ist, dieStrahl sauber durch die Iris entlang der gesamten Strahlengang passieren. </li></ol></li><li> Montieren Sie eine abgestimmte Achromat Paar (f = 30 mm) vor der Kamera. </li></ol> 2. Horizontale Stufe des Spektrometers <ol><li> Montieren Sie die horizontale Maske. <ol><li> Verwenden Stellschrauben, um die horizontale Maske auf einen Beitrag anzuhängen. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. Montieren Sie die Stelleninhaber auf eine Translationsstufe, so dass die Maske, um horizontal in und aus dem Strahlengang schieben. (Figur 1) </li><li> Verwenden Schrauben um die Translationsphase auf dem optischen Tisch, so daß die Maske scharf auf die CCD-Kamera in der Brennweite (f = 30 mm) der achromatischen Linsenpaar abgebildet anziehen. </li></ol></li><li> Halterung und Ausrichtung der sphärischen Linse S1 (f = 200 mm) 600 mm vor der horizontalen Maske. <ol><li> Verwenden Stellschrauben zu S1 auf einen Stelleninhaber zu montieren. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. </li><li> Montieren Sie zwei Irisblenden wie in 1.5.1 beschrieben. Vor placing S1 im Strahlengang, legen Sie eine Blende vor und eine Blende, nachdem die gewünschte Position S1 (600 mm vor der horizontalen Maske). Einstellen der Höhe der Iris, daß der Strahl sauber durch beide hindurchtritt. </li><li> Platzieren S1 600 mm vor der horizontalen Maske (Abbildung 1). Passen Sie Höhe und Winkel der S1 bis sowohl die Rückreflexion von der Linse und dem Out-kommenden Strahl, sauber durch die Iris übergeben. Ziehen Sie die Stelleninhaber hält S1 auf die optische Tisch mit Tischklemmen. </li></ol></li><li> Halterung VIPA2 in der Brennebene der Kugellinse (200 mm vor S1). <ol><li> Montieren Sie den VIPA Halter auf einem Pfosten mit den Schrauben mit dem Halter vorgesehen ist. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. Ziehen Sie die Stelleninhaber auf eine horizontale Verschiebetisch. (Figur 1) </li><li> Zeigen VIPA2 vorsichtig in die VIPA Halter mit dem Eingangsspalt vertikal ausgerichtet. (Figur 1) </li><li> Feineinstellung der Position of die VIPA montieren, um genau in der Brennebene S1 liegen. (Prüfen Sie, indem Sie der Strahltaille mit einer weißen Karte.) </li><li> Verwenden Schrauben, um die Translationsstufe auf die optische Tisch und schieben VIPA2 aus dem Strahl mit der Freiheitsgrad der Translationsstufe fest. </li></ol></li><li> Halterung und Ausrichtung der sphärischen Linse S2 (f = 200 mm) 200 mm nach dem VIPA und 200 mm vor der horizontalen Maske. Folgen Sie dem in 2.2.1-2.2.3 beschriebenen Vorgehensweise. Anstelle der Befestigung der Stelleninhaber auf den optischen Tisch, montieren Sie ihn auf eine Stufe mit seinen translatorischen Freiheitsgrad entlang der optischen Achse ausgerichtet ist. (Abbildung 1) Verwenden Sie Schrauben, um die Translationsstufe auf die optische Tabelle anziehen. </li><li> Verwenden Sie die horizontale Translationsstufe (2.3.4), die VIPA2 Eingang in den Strahlengang schieben. Beachten Sie vertikale Linien auf dem Kamerabild. <ol><li> Feineinstellung S2 mit der Translationsstufe 2.4 montiert, bis die vertikalen Linien auf dem Kamerabild angezeigtscharf. </li></ol></li><li> Passen Sie das Spektrum mit der horizontalen Neigefreiheitsgrad auf der VIPA Halter und der Translationsstufe. Verwenden Sie die horizontale-Übersetzung Freiheitsgrad zu stimmen den Eingang Position des Strahls in das Etalon. Verwenden der horizontalen Neigungsfreiheitsgrad zum Abstimmen des Eingangswinkel des Strahls in das Etalon. </li><li> Messen Sie Finesse und Durchsatz. <ol><li> Nehmen Sie ein Bild durch Drücken der Taste F5 oder alternativ, indem Sie auf &quot;Übernahme-Setup&quot; in der oberen linken Ecke und wählen Sie die Option &quot;Bild nehmen&quot; in der Kamera-Software. </li><li> Mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie die Option &quot;Liniendiagramm&quot;. Ziehen Sie den Cursor horizontal über das Bild, um ein Liniendiagramm zu erzeugen. Lassen Sie den Cursor, um die erzeugten Liniendiagramm zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie das Liniendiagramm, um die Finesse zu messen. Teilen Sie den Abstand zwischen zwei Spitzen, die durch ihre Halbwertsbreite (FWHM). Ziel für&gt; 30. </li><li> Bestimmen Sie den Durchsatz um measuring die Leistung mit einem Leistungsmesser unmittelbar vor und nach VIPA2. Zielen Sie auf&gt; 50%. </li><li> Tune die Eingangswinkel des Strahls in das Etalon mit dem Freiheitsgrad auf der VIPA Halter (2.6) und beobachten Sie den Trade-off zwischen Finesse und Durchsatz. </li></ol></li><li> Wenn Finesse und Durchsatz nicht zufriedenstellend sind zurück und Feineinstellung der Ausrichtung. Sicherstellen VIPA2 ist in der Brennebene S1. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.3 -2.7. </li></ol> 3. Vertikale Stufe Spectrometer <ol><li> Schieben Sie den VIPA (VIPA2), in Teil 2 ausgerichtet ist, aus dem Strahl mit der Translationsstufe (2.3.4). 1-Abbildungssystem: Die horizontale Phase des Spektrometers wird nun als 1 verhalten. </li><li> Montieren Sie die vertikale Maske. <ol><li> Verwenden Stellschrauben, um die vertikale Maske auf einen Beitrag anzuhängen. Ziehen Sie einen Beitrag zu einem rechten Winkel Beitrag Zangenadapter. Ziehen Sie einen zweiten Beitrag in die richtige Winkeladapter und steckte es in einen Stelleninhaber. Montieren Sie die Stelleninhaber auf eine vertikale Translationsstufe, allowing die Maske vertikal in und aus dem Strahlengang zu gleiten. (Figur 1) </li><li> Verwendung Schrauben, die vertikale Translationsstufe auf den optischen Tisch, dass die vertikale Maske scharf auf die EMCCD- Kamera 200 mm vor S1 abgebildet anziehen. </li></ol></li><li> Halterung und richten Sie die Zylinderlinse C1 (f = 200 mm) 600 mm vor der vertikalen Maske. <ol><li> Schrauben Sie die Zylinderlinsenhalter auf einem Post. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. Vorsichtig C1 in den Linsenhalter und die Schrauben anziehen, um es zu fixieren. </li><li> Montieren Sie zwei Irisblenden wie in 1.5.1 beschrieben. Vor dem Einsetzen C1 im Strahlengang, legen Sie eine Blende vor und eine Blende, nachdem die gewünschte Position S1 (600 mm vor der vertikalen Maske). Einstellen der Höhe der Iris, daß der Strahl sauber durch beide hindurchtritt. </li><li> Ort C1 600 mm vor der vertikalen Maske (Abbildung 1). Die Höhe, Neigung und seitliche Position C1 bis vorsichtig einstellenSowohl der Rückreflexion von der Linse und der out-kommenden Strahl, werden auf der Iris zentriert ist. Ziehen Sie die Stelleninhaber Halte C1 auf die optische Tisch mit Tischklemmen. </li></ol></li><li> Halterung VIPA1 in der Fokusebene der Zylinderlinse (200 mm vor C1). <ol><li> Montieren Sie den VIPA Halter auf einem Post mit der Schraube mit dem Halter vorgesehen ist. Ziehen Sie die Post in eine Posthalter. Ziehen Sie die Stelleninhaber auf eine vertikale Verschiebetisch. (Figur 1) </li><li> Zeigen VIPA1 vorsichtig in die VIPA Halter mit dem Eingangsspalt horizontal ausgerichtet. (Figur 1) </li><li> Feineinstellung der Position der VIPA montieren, um VIPA1 genau in der Brennebene der C1 zu platzieren. (Prüfen Sie, indem Sie der Strahltaille mit einer weißen Karte.) </li><li> Verwenden Schrauben, um die vertikale Translationsstufe auf die optische Tisch ziehen und schieben VIPA1 aus dem Strahl mit der Freiheitsgrad der Translationsstufe. </li></ol></li><li> Montieren und ausrichtenZylinderlinse C2 (f = 200 mm) 200 mm nach VIPA1 und 200 mm vor der vertikalen Maske, nach dem in 3.3.1-3.3.3 beschriebenen Vorgehensweise. Anstelle der Befestigung der Stelleninhaber auf den optischen Tisch, montieren Sie ihn auf eine Stufe mit seinen translatorischen Freiheitsgrad entlang der optischen Achse ausgerichtet ist. (Abbildung 1) Verwenden Sie Schrauben, um die Translationsstufe auf die optische Tabelle anziehen. </li><li> Verwenden Sie die Übersetzungsstufe (3.4.4), um die VIPA1 Eingang in den Strahlengang schieben. Beobachten horizontalen Linien auf dem Bild der Kamera. <ol><li> Feineinstellung C2 mit der Translationsstufe 3.5 montiert, bis die horizontalen Linien auf dem Kamerabild erscheint scharf. </li></ol></li><li> Passen Sie das Spektrum mit der vertikalen Neigefreiheitsgrad auf der VIPA Halter und der Translationsstufe. Verwenden die Vertikal Übersetzung Freiheitsgrad zur Abstimmung der Eintrittsposition des Strahls in dem Etalon. Verwenden die Vertikalneigungsfreiheitsgrad zum Abstimmen des Eingangswinkel des Strahls in die etalam. </li><li> Messen Sie Finesse und Durchsatz. <ol><li> Führen Sie die Schritte 2.7.1 -2.7.2 um ein Liniendiagramm vertikal über einem Bild von dem Kameradisplay zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie das Liniendiagramm, um die Finesse, indem man den Abstand zwischen zwei horizontalen Linien durch ihre Halbwertsbreite (FWHM) zu messen. Ziel für&gt; 40. </li><li> Messen Sie den Durchsatz durch Messen der Leistung mit einem Leistungsmesser unmittelbar vor und nach VIPA1. Zielen Sie auf&gt; 30%. </li><li> Abstimmung der vertikalen Eingangswinkel des Strahls in dem Etalon mit dem vertikalen Neigungsfreiheitsgrad auf dem VIPA Halter (3.7). Beachten Sie die Trade-off zwischen Finesse und Durchsatz. </li></ol></li><li> Wenn Finesse und Durchsatz nicht zufriedenstellend sind zurück und Feineinstellung der Ausrichtung. Sicherstellen VIPA1 ist in der Brennebene des C1. Wiederholen Sie Schritt 3.4.3-3.8. </li></ol> 4. Kombination der beiden Stufen und endgültige Ausrichtung <ol><li> Schieben Sie in VIPA2. Beobachten horizontal und vertikal beabstandeten Punkten. Diese Punkte are die spektrale Signatur des Einzelfrequenz-Laser. Passen Sie die Translationsstufen der Vipas, bis die Punkte scharf. </li><li> Messen Sie Finesse und Durchsatz des Spektrometers. <ol><li> Führen Sie die Schritte 2.7.1.-2.7.2 um ein Liniendiagramm diagonal über zwei der Laserpunkte zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie das Liniendiagramm, um Finesse aus der Division des diagonalen Abstand zwischen zwei Punkten, die durch ihre Halbwertsbreite (FWHM) zu messen. Ziel für&gt; 30. </li></ol></li><li> Erstellen Sie eine Black Box, um das Spektrometer zu umschließen. <ol><li> Verwenden Konstruktion Schienen, die Box Skelett, das die gesamte Spektrometer vom Faserkollimator zur CCD-Kamera (63 x 9 x 15 in) umschließen soll bauen. </li><li> Decken Sie die Box Skelett mit Blackout Stoff und kleben sie fest an den Ecken. Stellen Sie sicher, dass die Masken und die Vipas leicht zugänglich sind. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Faser zu einem optischen Standard-Sonde, wie beispielsweise ein Reflexions Konfokalmikroskop 4. Standard optische pGewänder verwendet, um rückgestreute Licht zu sammeln durchführen wird eine Brillouin-Signals. </li></ol> 5. Messung der Brillouin-Verschiebung <ol><li> Schließen sowohl die vertikale und die horizontale Masken, bis die Laserschrift verschwindet. Verschieben Sie die Übersetzungsstufen entsprechend. </li><li> Aktivieren Sie die Verstärkung und die Integrationszeit der Kamera so weit wie möglich zu erhöhen, ohne Sättigung des EMCCD Kamera. </li><li> Beachten Sie die Brillouin-Verschiebung einer Probe. <ol><li> Legen Sie eine Probe im Fokus eines konfokalen Mikroskops (oder andere optische Sonde). Die räumliche Auflösung wird auf die Objektivlinse in dem konfokalen Mikroskop abhängen. Verwenden Sie eine Kunststoffschale oder eine Küvette für Flüssigkeiten. Verwenden Methanol für die erste Messung. </li></ol></li><li> Zum Spektrometer Durchsatz, öffnen Sie eine Maske in einer Zeit, zu optimieren und zu scannen durch die Spektrometer Bestellungen durch Kippen des VIPA und Anpassung der Verschiebetisch. Finden Sie die Reihenfolge, in der das Signal am stärksten erscheint. Schließen Maske wieder, bis the Lasersignal verschwindet. Wiederholen Sie mit der anderen Maske und VIPA (in 2.6 und 3.7 beschrieben). </li><li> Nehmen Sie eine Messung der Probe. <ol><li> Nehmen Sie ein Bild des Spektrums folgenden Schritt 2.7.1. </li><li> Erhalten Kalibrierungsmessungen, indem sie ein Bild des Spektrums von Wasser und Glas (oder eine andere Probe mit bekannten Brillouin-Verschiebung). Speichern Sie das Bild, indem Sie auf &quot;Datei&quot; in der oberen linken Ecke und wählen Sie die Option &quot;Speichern unter&quot;. Speichern Sie das Bild in &quot;SIF&quot; Format, wenn die Datenanalyse in der Kamera-Software durchgeführt. Speichern Sie das Bild in &quot;.tif&quot; Format, wenn die Datenanalyse in einem anderen Computersoftwareprogramm durchgeführt. </li></ol></li></ol> 6. Kalibrierung und Analyse der Brillouin-Spektrum <ol><li> Bestimmen Sie die freie Spektralbereich (FSR) und der EMCCD Pixel zu optischen Frequenzumwandlungsverhältnis (PR) in der Brillouin-Spektrometer. <ol><li> Laden Sie die Daten in der Kamera-Software oder einem anderen Computacentertionalen Software-Programm. </li><li> Folgen Sie Schritt 2.7.2 um ein Liniendiagramm über das gesamte Spektrum von Wasser Kalibrierungsbild der zu generieren. </li><li> Montieren Sie die beiden Spitzen des Spektrums mit Lorentz-Kurven, um Spitzenpositionen in Bezug auf die Pixelposition (P Wasser-S, P Wasser-AS) zu bestimmen. Alternativ können Sie die Spitzenpositionen ausgelesen manuell, indem sie den höchsten Punkt der Gipfel. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6.1.2-6.1.3 mit dem Spektrum des Glases Kalibrierbild. </li><li> Alternativ zu 6.1.1-6.1.4, fügen Sie beide EMCCD Rahmen und passen auf alle vier Peaks auf einmal. (Figur 2) </li><li> Berechnen Sie die PR unter Verwendung von Gleichung 1. Schließen Sie die Werte für P Wasser-AS und P Glass-AS in 6.1.3 und 6.1.4 festgelegten. Ω Glass-AS bekannt, um 29,3 GHz. In diesem Fall, da der freie Spektralbereich ist nur 20 GHz wird die Frequenzverschiebung von 9,3 GHz aliased erscheinen. Der Einfachheit halber verwenden 9.3 GHz für Ω Glass-AS. Verwenden Sie 7,46 GHz für ΩWasser-AS. <img alt="Gleichung 1" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq1.jpg" /></li><li> Berechnen Sie die FSR unter Verwendung von Gleichung 2. Schließen Sie die Werte für P Glass-S, P Glass-AS und PR, in 6,16 berechnet. Verwenden Sie 9,3 GHz für Ω Glass-AS. <img alt="Gleichung 2" class="jove_content" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq2.jpg" /></li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" class="jove_content" src="/files/ftp_upload/53468/53468fig2.jpg" /> Abbildung 2. Spektrometer Kalibrierung. (A) EMCCD Kamera Rahmen aus Eichprobe erhalten. (B) Lorentz-Kurvenanpassung (rot) an die gemessenen Daten (blau). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53468/53468fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Bestimmen Sie die Brillouin-Verschiebungein Beispiel. <ol><li> Folgen Sie Schritt 2.7.2 um einen Zeilen über das gesamte Spektrum der Probe zu erzeugen. </li><li> Montieren Sie die beiden Spitzen des Spektrums mit Lorentz-Kurven, um Spitzenpositionen in Bezug auf die Pixelposition zu bestimmen. Alternativ können Sie die Spitzenpositionen ausgelesen manuell, indem sie den höchsten Punkt der Gipfel. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Gleichungen 4 und 5 und die zuvor berechneten Werte für FSR und PR, um die Brillouin-Verschiebung der Probe zu berechnen. <img alt="Gleichung 3" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

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Giuliano Scarcelli and Seok H. Yun hold patents related to Brillouin spectroscopy technology.

Ein wesentliches Konstruktionsmerkmal dieses Spektrometers Konfiguration ist, dass die beiden Stufen unabhängig ausgerichtet werden. Wenn ein VIPA Etalon wird aus dem optischen Weg geschoben, werden die restlichen Linsen des Spektrometers Stufe bilden ein 1: 1-Abbildungssystem, so dass die spektrale Muster von jeder Stufe wird auf die CCD-Kamera abgebildet. Daher ist es einfach, wieder auf eine der beiden Stufen zu gehen, um seine Leistung, ohne die Ausrichtung der anderen Stufe zu verbessern. Die Menge der Translation...

Brillouin-Streuung, die zuerst von Leon Brillouin 1 1922 beschrieben, ist die unelastische Streuung von Licht aus der thermischen akustischen Moden in einer festen und aus den thermischen Dichteschwankungen in einer Flüssigkeit oder einem Gas. Die Spektralverschiebung des gestreuten Lichts, in der Regel in der Sub-GHz-Bereich, stellt Informationen über die Wechselwirkung zwischen dem einfallenden Licht und den akustischen Phononen in der Probe. Als Ergebnis kann nützliche Informationen hinsichtlich der viskoelastischen Eigenschaften des untersuchten Materials. In seiner spontanen Version weist Brillouin-Streuung im allgemeinen Querschnitte in der Grßenordnung von Raman-Streuung, was in einem sehr schwachen Signal. Zusätzlich Brillouin-Frequenzverschiebungen sind um Größenordnungen kleiner als die Raman-Verschiebungen. Als Folge davon elastisch gestreute Licht (von Rayleigh und Mie-Streuung), Streulicht, und Back-Reflexionen an der Probe kann alle leicht überschatten die Brillouin spektrale Signatur. DaherMuss ein Brillouin-Spektrometer, um nicht nur zu erreichen Sub-GHz spektrale Auflösung, sondern auch hohe spektrale Kontrast oder vom Aussterben bedroht. In traditionellen Brillouin Spektrometer diese Anforderungen von Raster Gittermonochromatoren optische schlagMethoden und am populärsten, Mehrfachabtastung Fabry-Perot-Interferometer 2 erfüllt. Diese Methoden messen jede spektrale Komponente der Reihe nach. Dieser Ansatz führt zu Erfassungszeiten für einzelne Brillouin Spektrum im Bereich von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden in Abhängigkeit von dem Gerät und auf der Probe. Das zweistufige VIPA Spektrometer aufgebaut unter Verwendung dieses Protokolls, hat die Fähigkeit, alle Spektralkomponenten innerhalb von weniger als einer Sekunde zu sammeln, während eine ausreichende Extinktion (&gt; 60 dB) zu anderen Störsignalen 2 wirksam zu unterdrücken. Die Integration der VIPA Etalons ist das Schlüsselelement dieses Spektrometers. Ein VIPA ist ein solides Etalon mit drei verschiedenen cFloating-Bereichen: in der vorderen Oberfläche, ermöglicht eine enge Antireflexbeschichtung Streifen das Licht, um das VIPA geben, während der Rest der Oberfläche verfügt über eine hochreflektierende (HR) Beschichtung; in der hinteren Fläche ermöglicht eine teilweise reflektierende Beschichtung ein kleiner Teil (ca. 5%) des Lichts zu übertragen sind. Wenn auf den schmalen Eingang des leicht geneigten VIPA fokussiert, wird der Lichtstrahl in Teilkomponenten mit festen Phasendifferenz innerhalb des VIPA 2 reflektiert. Interferenzen zwischen den Teilkomponenten erreicht die angestrebte hohe spektrale Dispersion. Sequentielles Ausrichten von zwei Vipas in Querachsenkonfiguration stellt spektrale Zerlegung in orthogonalen Richtungen 3. Die spektrale Dispersion in orthogonalen Richtungen räumlich trennt die Brillouin-Peaks vor unerwünschten Übersprechen, das es ermöglicht, holen nur die Brillouin-Signals ermöglicht. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des zweistufigen VIPA-Spektrometer. Die Pfeile unterhalb der optischen Elemente zeigen die DEGreie Freiheits in dem die Translationsstufen orientiert werden sollte. <img alt="Abbildung 1" class="jove_content" p="" src="/files/ftp_upload/53468/53468fig1.jpg" /> Abbildung 1. Instrumental-Setup. Eine optische Faser liefert die Brillouin-Streuung in das Spektrometer. Eine zylindrische Linse C1 (f = 200 mm) fokussiert das Licht in den Eingang des ersten VIPA (VIPA1). Eine weitere zylindrische Linse C2 (f = 200 mm) bildet die spektrale Winkeldispersion in eine räumliche Trennung in der Brennebene der C2. In dieser Ebene wird eine vertikale Maske verwendet, um den gewünschten Teil des Spektrums auszuwählen. Eine analoge Konfiguration folgt, bei 90 Grad geneigt ist. Der Strahl durch eine sphärische Linse S1 (f = 200 mm) und wird in den Eingangsschlitz des zweiten VIPA (VIPA2) konzentriert. Eine sphärische Linse S2 (f = 200 mm) erzeugt die zweidimensionale spektral getrennten Muster in ihrer Brennebene, wo eine andere horizontale Maske platziert ist. Die horrechten Maske wird auf das EMCCD Kamera über eine achromatische Linsenpaar abgebildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53468/53468fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ein Bachelor-Student mit einigen Optik Kursarbeit und Grund Ausrichten Erfahrungen sollten in der Lage zu bauen und benutzen Sie diesen zweistufigen Spektrometer sein. Das Spektrometer wurde kürzlich gezeigt, mit einer Vielzahl von optischen Standard-Sonden 3,4,5 (zB Konfokalmikroskop Endoskop Spaltlampen Ophthalmoskop) kompatibel zu sein. Hier ist das Spektrometer mit einem konfokalen Mikroskop verbunden ist. Das Laserlicht wird, nachdem die Integration eines 90:10 Strahlteiler in einen Standardforschungs invertierten Mikroskopsystem ausgerichtet ist. Die Rückstreuung von Licht von der Probe wird in einer Einmodenfaser gekoppelt ist, so dass das Mikroskop konfokalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTICS:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VIPA (virtual image phase array)</td>
			<td style="width:71px;">LIGH MACHINERY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td style="width:119px;">423-MIC&#160;</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>9066-X</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>SM-13</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Adjustable Width Slit</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>SV-0.5</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in.</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>DS40-Z</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slotted Base Plate, 25 or 40mm to 65mm Stage, 1.1 in. Range</td>
			<td style="width:71px;">NEWPORT</td>
			<td>B-2B</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4&#34;-20 Tap, L = 2&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>TR2-P5</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PH2-P5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#216;1/2&#34; Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3&#34;, 5 Pack</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PH3-P5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Imperial Lens Mount For 2&#34; Optics, 8-32 Tap</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>LMR2</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">f=200.0 mm, &#216;2&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>AC254-200-A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Kinematic Mount for up to 1.3&#34; (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>KM100C</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60&#34; (40.6 mm)</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>CH1A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">f = 200.00 mm, H = 30.00 mm, L = 32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>L1653L1-A</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Right-Angle Post Clamp, Fixed 90&#176; Adapter</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Studded Pedestal Base Adapter, 1/4&#34;-20 Thread</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>PB4</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spacer, 2&#34; x 3&#34;, 1.000&#34; Thick</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>Ba2S7</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg.</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>F260APC-A</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SM1-Threaded Adapter for &#216;11 mm collimators</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>Ad11F</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Translating Lens Mount for &#216;1&#34; Optics, 1 Retaining Ring Included</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>LM1XY</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>P3-460B-FC-2</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>MAP103030-A</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SM1 Lens Tube&#8230;length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SM1LXX</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Base Adapters for &#216;1/2&#34; Post Holders and &#216;1&#34; Posts</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>BE1</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clamping Forks for&#160; &#216;1/2&#34; Post Holders and &#216;1&#34; Posts</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>CF125</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series&#160;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>HW-KIT5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">D20S - Standard Iris, &#216;20.0 mm Max Aperture&#160;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>D20S</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FOR ENCLOSURE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 21&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L21</td>
			<td>Quantity: 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#34; Construction Cube with Three 1/4&#34; (M6) Counterbored Holes</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>RM1G</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25A90</td>
			<td>Quantity: 12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 15&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L15</td>
			<td>Quantity: 4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">25 mm Construction Rail, L = 9&#34;</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25L09</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">High Performance Black Masking Tape, 2&#34; x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>T743-2.0</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-Profile T-Nut, 1/4&#34;-20 Tapped Hole, Qty: 10</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>XE25T3</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#160;1/4&#34;-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box)</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>SH25LP38</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">60&#34; (W) x 3 yds. (L) x 0.005&#34; (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td>BK5</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CAMERA,&#160; LASER and MICROSCOPE&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:71px;">ANDOR</td>
			<td style="width:119px;">iXon Ultra 897</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">400 mW single mode green laser</td>
			<td style="width:71px;">LASER QUANTUM</td>
			<td style="width:119px;">torus 532</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Research Inverted System Microscope&#160;</td>
			<td style="width:71px;">OLYMPUS</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis

Das Ziel des Protokolls ist es, eine parallele hoher Extinktion und hochauflösende optische Brillouin-Spektrometer zu bauen. Brillouin-Spektroskopie ist eine berührungslose Messverfahren, die verwendet werden kann, um direkte Auslesen der viskoelastischen Materialeigenschaften zu erhalten. Es ist ein nützliches Werkzeug in der Materialcharakterisierung, Strukturüberwachung und Umweltanalytik. In der Vergangenheit hat die Brillouin-Spektroskopie üblicherweise verwendeten Scan Fabry-Perot-Etalons zur Spektralanalyse durchzuführen. Dieser Prozess erfordert hohe Lichtleistung und lange Akquisitionszeiten, so dass die Technik für biomedizinische Anwendungen ungeeignet. Ein kürzlich vorgestellten neuen Spektrometers überwindet diese Herausforderung, indem zwei Vipas in einer Querachsenkonfiguration. Diese Innovation ermöglicht es Unter Gigahertz (GHz) Auflösung Spektralanalyse mit Sub-Sekunden Aufnahmezeit und Beleuchtungsleistung innerhalb der Sicherheitsgrenzen von biologischem Gewebe. Die mehrfachen neuen Anwendungen von dieser Verbesserung erleichtert sind currently in der biologischen Forschung und klinischer Anwendung erforscht.

<html> Abbildung 3 zeigt repräsentative Brillouin-Spektren und ihre Sitze für verschiedene Materialien. Die Vipas beide eine Dicke von 5 mm, die in einem FSR Ergebnisse von ungefähr 20 GHz. Die Integrationszeit für diese Messungen betrug 100 msec. 100 Messungen durchgeführt und gemittelt. Ein Kalibrierungsmessung wurde vor dem Erwerb der Spektren aufgenommen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53468/53468fig3.jpg" /> <str...

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High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine schnelle Brillouin-Spektrometer zu bauen. Cascading virtuell abgebildeten Phasen-Array (VIPA) Etalons erreichen eine Messgeschwindigkeit mehr als 1.000 mal schneller als herkömmliche Scan Fabry-Perot-Spektrometer. Diese Verbesserung stellt die Mittel für die Brillouin-Analyse von Gewebe und Biomaterialien bei niedrigen Leistungspegeln in vivo.

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

high-speed-sub-ghz-spectrometer-for-brillouin-scattering-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Aufrufe.  University of Maryland.  Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine schnelle Brillouin-Spektrometer zu bauen. Cascading virtuell abgebildeten Phasen-Array (VIPA) Etalons erreichen eine Messgeschwindigkeit mehr als 1.000 mal schneller als herkömmliche Scan Fabry-Perot-Spektrometer. Diese Verbesserung stellt die Mittel für die Brillouin-Analyse von Gewebe und Biomaterialien bei niedrigen Leistungspegeln in vivo. 

Serie: High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Verwendung von Nanoplasmon-Enhanced Scattering und Low-Magnification Microscope Imaging zur Quantifizierung von Tumor-Derivate-Exosomen

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

High Speed Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis