D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

Remarque: Les étapes 1 et 2 ont lieu avant le jour de l&#39;imagerie; assurer tous les médias et les suppléments pour être utilisés avant ou le jour de l&#39;imagerie sont équilibrées. L&#39;équilibrage est réalisé par le réchauffement des médias et des suppléments à 37 ° C dans un incubateur réglé à 5% de CO 2. Toutes les étapes des travaux de culture cellulaire et lamelle placage se déroulent dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. 1. transfection des cellules <ol><li> Transfecter les cellules T à imager 24 h avant l&#39;expérience avec un plasmide codant pour une fusion pour construire fluorescent F-actine étiquetage de la GFP et de l&#39;imagerie. Remarque: Les cellules doivent être séparées de 24 heures avant la transfection (48 heures avant l&#39;imagerie) pour assurer cellules sont à une santé optimale et dans leur phase de croissance logarithmique. <ol><li> Placez 5 ml de supplément RPMI (RPMI 1640 plus 10% de FBS et 1% Pen-Strep (facultatif)) dans un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits dans l&#39;incubateur pour équilibrer. </li><li> Pastille 2 x 10 7 cellules T culterée à 37 ° C 5% de CO 2 en supplément RPMI en utilisant un tube de centrifugation à 327 g pendant 5 min et laver dans un volume égal de milieu d&#39;électroporation préchauffé. Remarque: moyen électroporation est un milieu de sérum réduit contenant des tampons et des suppléments (voir consommables). </li><li> Après re-granulation à 327 xg pendant 5 min, remettre les cellules dans 500 ul de milieu d&#39;électroporation et ajouter lentement à une cuvette, ajouter 5 pg du plasmide dans la PCR note dH 2 O pour le marquage F-actine. </li><li> Tapoter doucement la cuvette sur l&#39;espace de travail de la hotte pour assurer l&#39;élimination de toutes les bulles d&#39;air dans les médias, ce qui peut provoquer un arc de l&#39;électricité et de distribuer les cellules uniformément dans les médias. </li><li> Allumez l&#39;appareil d&#39;électroporation et de régler la tension de 300 V et la capacité à 290 Ω. Échantillon électroporer utilisant une décroissance exponentielle pendant 20 msec. Note: L&#39;optimisation peut être exigée pour différentes cellules et les différentes constructions plasmidiques. </li><li> Une fois que le protocole de transfection estcomplets, des cellules de stocker sur la glace pendant 1 min avant de poursuivre. </li><li> Soigneusement transférer les cellules de la cuvette à la plaque de 6 puits contenant 5 ml de supplément RPMI équilibrée de l&#39;étape 1.1.1. </li><li> Incuber les cellules O / N à 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. lamelles de manteaux et Supplément d&#39;imagerie pré-chaud <ol><li> Des lamelles de Coat avec des anticorps pour induire la stimulation des cellules T. <ol><li> Manteau chaque chambre d&#39;une lamelle de 8 puits avec 1 pg / ml αCD3 et αCD28 dans 200 pi de PBS. </li><li> Conserver à 4 ° CO / N. Alternativement, des lamelles de Coat 2 h avant à l&#39;imagerie et de garder dans un incubateur à 37 ° C pour réduire la dérive pendant le processus d&#39;imagerie en minimisant les changements de température à la lamelle. </li></ol></li><li> Créer un échantillon de test de lamelle avec 0,1 um sous-diffraction microsphères fluorescentes. <ol><li> Vortex solution stock de perles pour éviter les grumeaux. </li><li> Sur une nouvelle, propre lamelle de ee même type que ceux utilisés à l&#39;étape 2.1.1, une pipette 5 pi microsphère fluorescente solution stock sur la surface (selon les instructions du fabricant). </li><li> Répandre la solution de microsphères sur la lamelle avec la pointe de la pipette. </li><li> Laisser sécher, puis appliquer 200 pi de milieu de montage tels que PBS. Remarque: le milieu de montage doit correspondre à celui utilisé pour les échantillons de cellules d&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Equilibrer HBSS (+ 20 mM de HEPES, ci-après dénommé «HBSS supplément &#39;) dans un tube de centrifugation en plaçant dans un incubateur à une pré-O chaud / N à 37 ° C + 5% CO 2. Remarque: l&#39;ajout de HEPES est de tamponner CO 2, si vous utilisez une chambre d&#39;incubation avec le CO 2 entrée sauter cette supplémentation. </li></ol> 3. Microscope Set-up <ol><li> Tournez sur la scène haut-incubateur du microscope et le lieu suffisamment d&#39;eau distillée FRBR-SIM dans le réservoir du microscope pour couvrir entièrement la base de l&#39;élément de chauffage. Permettre à l&#39;eau à l&#39;equilibrate à 37 ° C. Ajouter le collier de chauffage à l&#39;objectif, également mis à 37 ° C. Remarque: En raison de la sensibilité du set-up, ces étapes sont effectuées la nuit avant de sorte que les composants optiques sont à une température stable avant l&#39;imagerie. </li><li> Placez la FRBR 488 bloc réseau compatible dans le trajet de la lumière du microscope et de fixer en place. <ol><li> Changez le mode de canal et le câble de fibre à la position «unique» sur la scène de lit et d&#39;un microscope laser respectivement à engager le chemin optique correcte pour le mode FRBR-SIM. Remarque: Sauter cette étape va conduire à une erreur (figure 1A) dans la fenêtre du logiciel. </li></ol></li><li> Mettez tous les microscopes et d&#39;ordinateurs composants et ouvrez le logiciel de commande d&#39;acquisition. <ol><li> Ouvrez le panneau de OC, Ti Pad, N-SIM Pad et ND Acquisition fenêtres (figure 1B). Dans le &quot;Panneau de OC &#39;sélectionnez l&#39;option&#39; FRBR 488 &#39;(figure 2B, flèche jaune). </li&gt; <li> Dans la fenêtre N-SIM Pad, sélectionnez la FRBR-SIM »et les paramètres« en mouvement »(figure 2C, flèches jaunes). Sélectionnez le bouton Paramètres (Figure 1C, boîte jaune) et sélectionnez «FRBR 488 (100x pour la FRBR 488nm) &#39;dans le menu déroulant, frappé« Appliquer »et« OK ». </li><li> Définissez les paramètres de la caméra dans les «Paramètres de DU897 &#39;à: Frame Rate 50 ms, lecture en mode, EM gain de 3 MHz à 14-bit, et EM Gain multiplicateur 300 avec un gain de conversion de 1 (figure 1C, la boîte verte). Remarque: voir des résultats représentatifs pour des considérations de taux de trame. </li><li> Calibrer l&#39;éclairage du microscope pour la FRBR-SIM, en sélectionnant l&#39;objectif 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sur le «N-SIM Pad &#39;tourner la puissance du laser 488 nm à 10%. Remarque: La taille des pixels des images brutes est de 60 nm, avec un champ de vision de 512 x 512 pixels. </li><li> Nettoyez l&#39;objectif en utilisant des tissus de verre pour enlever la poussière et l&#39;huile. </li></ol></li&gt; <li> Trouver le plan focal de la FRBR-SIM. <ol><li> Commencez avec l&#39;objectif dans le plan z le plus bas possible. Placer une goutte d&#39;huile de lentilles de l&#39;objectif et ajouter l&#39;échantillon de microsphères fluorescentes provenant de l&#39;étape 2.2 de la platine du microscope. </li><li> Sélectionnez la fonction Parfait Focus System (PFS) situé sur le corps du microscope. </li><li> Lentement, déplacez l&#39;objectif à travers le plan z jusqu&#39;à ce que le bouton PFS cesse de clignoter pour confirmer le plan focal a été atteint. </li><li> Passez à la vue «Live» sur le logiciel de contrôle et de l&#39;image des microsphères pour les derniers ajustements effectués à l&#39;aide de la roue de micro-manipulateur PFS. </li></ol></li><li> Observez l&#39;éclairage uniforme sans émission de fluorescence out-of-focus-dessus de la 75 nm onde évanescente. Remarque: Confirmation illumination structurée est remplie par l&#39;observation d&#39;un motif d&#39;éclairage fluctuant à partir de l&#39;échantillon de microsphères fluorescentes. </li><li> Mesurer l&#39;échantillon de microsphères fluorescentes et de quantifier la résolut d&#39;imagerie amélioréeion en observant la largeur à mi-hauteur (FWHM) du profil d&#39;intensité. <ol><li> Ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez &quot;Applications&quot; -&gt; «Afficher la fenêtre N-SIM&quot;. </li><li> Avec l&#39;éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (figure 2), reconstruire l&#39;image de l&#39;échantillon de microsphères pour générer une image reconstruite de 1024 x 1024 pixels avec une taille de pixel de 30 nm. </li><li> Utilisation de l&#39;outil de profil de ligne d&#39;une largeur de 1 pixel (figure 3A, boîte jaune), tracer une ligne à travers le centre d&#39;une seule microsphère. </li><li> Sélectionnez le bouton FWHM (figure 3B, boîte jaune) et cliquez à l&#39;maxima d&#39;intensité de la distribution gaussienne, suivi par ses minima d&#39;intensité. </li><li> Confirmation de la FWHM de la microsphère est comprise dans l&#39;intervalle de 100 nm (Figure 3C). Remarque: la résolution achlorsque l&#39;imagerie d&#39;échantillons biologiques ieved varieront en fonction du signal de bruit à partir de l&#39;efficacité de marquage et la fluorescence de fond. </li></ol></li></ol> 4. Préparation de l&#39;échantillon pour l&#39;imagerie <ol><li> Préparation lamelle. <ol><li> Récupérer lamelle αCD revêtu de l&#39;étape 2.1 de réfrigérateur ou incubateur et retirer PBS contenant αCD3 et αCD28 de chaque puits. </li><li> Ajouter 200 ul de HBSS supplément préchauffé provenant de l&#39;étape 2.3 dans chaque puits de la lamelle. Laver et retirer les pour assurer un minimum de αCD3 et αCD28 est laissé en solution. Ajouter 200 ul d&#39;un autre supplément de la HBSS pour les puits de lamelle. </li><li> Nettoyez le dessous de la lamelle avec le tissu de lentille pour enlever l&#39;huile et les particules. </li></ol></li><li> Position lamelle sur la platine du microscope et de trouver le plan focal de la FRBR de la lamelle en utilisant le plan z PFS que l&#39;on trouve dans l&#39;étape 3.4. </li><li> La préparation des cellules. <ol><li> Introduire à la pipette 200 pi de la con de médiascontenant des cellules transfectées de l&#39;étape 1.1.8 dans un tube de micro-centrifugeuse. </li><li> Cellules de culot dans une micro-centrifugeuse à 268 g pendant 20 sec et retirer les supports de cellules. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 pi préchauffé supplément HBSS de l&#39;étape 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Les cellules d&#39;imagerie <ol><li> Prendre supplément HBSS contenant des cellules au microscope et la pipette 200 ul doucement dans l&#39;un des puits. </li><li> Tout en restant dans le plan focal de la FRBR à la lamelle (en mode PFS), utiliser le microscope oculaire et l&#39;éclairage à épifluorescence pour suivre cellules fluorescentes approchant la lamelle. </li><li> Une fois que les cellules se posent sur la lamelle, passer en mode &#39;Live&#39; dans la N-SIM Pad pour amener l&#39;image sur le moniteur et vérifier les cellules sont en discussion sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur. </li><li> Pour un temps record des cours, ouvrir la fenêtre ND Acquisition et sélectionnez l&#39;onglet &#39;Time&#39;, cliquez sur &#39;Ajouter&#39; et réglez «Interval» pas de retard, &#39;Durée&#39;à 10 min, &#39;boucles&#39; est mis à 1. Remarque: La durée peut être modifiée en fonction du procédé d&#39;intérêt; le logiciel STICS peut extraire des résultats quantitatifs avec piles d&#39;images de ≈ 10 cadres lorsqu&#39;il a été capturé avec &#39;No Delay&#39;. </li><li> Avec les réglages d&#39;acquisition identique à l&#39;échantillon de perles, commencer l&#39;enregistrement des données en sélectionnant &quot;Exécuter maintenant&quot; dans la fenêtre ND Acquisition. </li></ol> 6. Reconstruction SIM Images <ol><li> Après l&#39;imagerie est terminée, ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez &quot;Applications&quot; -&gt; «Afficher la fenêtre N-SIM&quot;. </li><li> Avec l&#39;éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (Figure 2), de reconstruire un (ou en utilisant l&#39;outil de lots multiples) de fichier SIM première pour produire une image reconstruite SIM. </li><li> Confirmez le fichier reconstruit a une taille de pixel de 30 nm, indiqué dans lel&#39;image barre d&#39;état. Remarque: La taille du pixel ne modifie pas l&#39;analyse des STICS mais il doit être au moins 2x plus petit en dimension à la résolution spatiale de la PSF afin d&#39;assurer la corrélation spatiale entre les pixels. </li><li> Exporter les données sous fichiers .tiff, prêt pour l&#39;analyse STICS. </li></ol> 7. Analyse STICS <ol><li> Télécharger et extraire le STIC (C) s package logiciel Matlab (Wiseman de laboratoire; disponibles comme information supplémentaire). Le stics_vectormapping.m de script est le noyau d&#39;une seule analyse des STICS canaux et les 30 premières lignes de code sont utilisés pour définir les paramètres d&#39;entrée tel que défini à la section 2.1 du manuel. Ouvrez ce script et de définir les paramètres d&#39;entrée pour la FRBR-SIM analyse des données. Il est suggéré d&#39;ajouter aussi le dossier de S STIC (C) avec des sous-dossiers à la machine chemin Matlab locale, comme détaillé dans l&#39;annexe du manuel. <ol><li> Définir les paramètres d&#39;entrée pour l&#39;analyse des données en modifiant les lignes correspondantes du code </li><li> Pour effectuer analyse des données FRBR-SIM pour générer une carte vectorielle, définissez les paramètres temporels à sous-région temporelle dans la ligne 31 le nombre maximal de trames et le décalage temporel dans la ligne 32 à 1. Pour obtenir une série chronologique de cartes vectorielles varier ces paramètres . </li><li> Pour le filtre d&#39;élimination Immobile, régler le paramètre «filtrage» (ligne 23) à «Moyenne mobile» et régler le paramètre &#39;MoveAverage&#39; (ligne 24) à 21. Remarque: Ce paramètre a été montré à travailler pour de grands signaux de fluorescence mouvement lent et, comme il est basé sur la soustraction cadres de série de la trame en cours d&#39;analyse. </li><li> Changer lignes 33-38 pour définir le nom des fichiers et les titres des cartes vectorielles de sortie de sortie, ainsi que le chemin du répertoire de sortie et définissent dans quel format les carte vectorielle images doivent être enregistrées. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Taille des pixels (pm) </td><td> 0.03 pm </td><td> Ligne 19 </td></tr><tr><td> Frame rate (sec) </td><td> 1 seconde </td><td> Ligne 20 </td></tr><tr><td> Temps de latence maximale (images) </td><td> 20 images </td><td> Ligne 21 </td></tr><tr><td> Taille de la sous-région (pixels) </td><td> 8 pixels </td><td> Ligne 29 </td></tr><tr><td> Espacement de la sous-région (pixels) </td><td> 1 pixel </td><td> Ligne 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Ouvrez les run1ChannelSTICS de script dans la fenêtre Editor Matlab. Chargez la série d&#39;image en exécutant lignes 1-23 de ce script. Remarque: Ce script peut être utilisé pour charger et pré-processus série d&#39;images, tracer les cartes vectorielles et des histogrammes de vitesse et de lancer un traitement par lots pour de nombreux fichiers. Si nécessaire, recadrer l&#39;image pour une région d&#39;intérêt en utilisant la ligne 24-26 de ce script. <ol><li> Exécuter les lignes 29-35 de run1ChannelSTICS pour commencer l&#39;analyse STICS. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez un polygone pour indiquer une région d&#39;intérêt (ROI), si désiré. Assurez-vous que le retour sur investissement ne se chevauchent pas avec le bord de la cellule, comme des artefacts limites se produisent lorsque STICS analyse ces rerégions. </li><li> Exécuter les lignes 38-52 pour afficher la carte de vecteur. Pour tracer l&#39;histogramme vitesse de grandeur, lignes 53-72 exécuter. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Cette technique permettra aux chercheurs de l&#39;image et de quantifier les détails précédemment insolubles dans les cellules exprimant la fluorescence. Dans nos résultats, nous montrons que la F-actine des flux d&#39;une manière symétrique à partir de la périphérie de la cellule vers le centre de la cellule dans la cellule T est. Ces résultats sont cohérents avec les résultats antérieurs de la ligne 1D données de profil kymographe 13 et étendent la capacité d&#39;analyse de données 2D et de...

Le but de l&#39;expérience est à l&#39;image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d&#39;établir le sens d&#39;écoulement et de l&#39;ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l&#39;imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l&#39;activation des lamelles revêtues d&#39;anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d&#39;antigène (APC) à l&#39;récepteur des cellules T (TCR) 1,2 d&#39;activation. Comme cela est la première étape pour déterminer si le système immunitaire adaptatif génère une réponse immunitaire à une infection, les conséquences de la réactivité aux stimuli incorrecte peut provoquer un certain nombre de maladies. L&#39;importance de l&#39;interaction des cellules T-APC est bien documentée, cependant, le rôle (s) de l&#39;adulte est après si TCR initialeinternalisation gnal sont pas encore pleinement compris. Comme le cytosquelette est pensé pour aider deux processus liés à l&#39;activation du TCR (le mouvement des molécules à la membrane plasmique et le contrôle des molécules dépendant du cytosquelette d&#39;actine 3,4 signalisation), de comprendre comment le cytosquelette réorganise spatialement et temporellement feront bien comprendre les étapes de la réorganisation moléculaire pendant la formation de la synapse. Le flux rétrograde de F-actine est pensé pour corral grappes TCR vers le centre de la synapse immunologique, cette translocation est considéré comme vital pour la cessation du signal et le recyclage; aidant l&#39;équilibre délicat de l&#39;activation des cellules T 5. Bien que la microscopie à fluorescence standard est un outil flexible qui continue de donner un aperçu sur de nombreux événements biologiques y compris les interactions cellule-cellule, elle est limitée par la capacité du système pour résoudre avec précision de multiples fluorophores résidant plus près que la Diffrlimite d&#39;action (≈200 nm) de l&#39;autre. Comme de nombreux événements moléculaires dans les cellules impliquent des populations denses de molécules et présentent réarrangement dynamique soit en repos ou lors de la stimulation spécifique, la microscopie optique conventionnelle ne fournit pas une image complète. L&#39;utilisation de l&#39;imagerie super-résolution a permis aux chercheurs de contourner la limite de diffraction en utilisant une variété de techniques. Seule molécule localisation microscopie (SMLM) tels que PALM et STORM 6,7 a la capacité de résoudre l&#39;emplacement de molécules jusqu&#39;à une précision de l&#39;ordre de 20 nm, cependant, ces techniques reposent sur ​​des temps d&#39;acquisition longues, construire une image sur plusieurs cadres . En général, cela nécessite des échantillons à être fixes ou pour les structures à faible mobilité présentent fluorophores si simples ne sont pas interprété comme de multiples points. Alors que l&#39;épuisement de l&#39;émission stimulée (STED) imagerie permet de super-résolution par le biais très sélectif confocale excitation 8, le balayage nécessaireapproche peut être lente sur des champs entiers de cellules de vue. STED démontre également phototoxicité important pour des résolutions plus élevées en raison de l&#39;augmentation de la puissance du faisceau d&#39;épuisement. Structuré microscopie éclairage (SIM 9) offre une alternative à ces méthodes, capables de doubler la résolution d&#39;un microscope à fluorescence standard et est plus compatible avec l&#39;imagerie des cellules vivantes que les techniques de SMLM actuelles. Il utilise des puissances inférieures laser, sur un système à grand champ pour les champs de cellules entières de vue; Fournir davantage des vitesses d&#39;acquisition, et est compatible avec l&#39;étiquetage fluorophore standard. La nature à grand champ de la carte SIM permet également l&#39;utilisation de la fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) pour l&#39;excitation hautement sélectif, avec des profondeurs de pénétration dans la dimension axiale de &lt;100 nm. Spectroscopie de corrélation d&#39;images (ICS) est une méthode de corrélation des fluctuations d&#39;intensité de fluorescence. Une évolution de ICS; Im spatio-temporelleâge spectroscopie de corrélation (STICS 10) corrèle signaux fluorescents intracellulaires dans le temps et l&#39;espace. En corrélant intensités de pixels entourant les pixels de retard dans des trames par l&#39;intermédiaire d&#39;une fonction de corrélation, l&#39;information est acquise en ce qui concerne les vitesses d&#39;écoulement et de directivité. Pour assurer objets statiques ne pas interférer avec l&#39;analyse STICS, un filtre d&#39;objet immobile est mis en œuvre, qui travaille en soustrayant une moyenne mobile des intensités des pixels. La technique présentée ici est considérée comme étant la première démonstration de la spectroscopie de corrélation d&#39;image étant appliqué à des données de microscopie super-résolution pour quantifier le flux moléculaire dans 11 des cellules vivantes. Cette méthode améliore l&#39;imagerie par diffraction limitée des flux F-actine via une analyse STICS 12 et conviendrait chercheurs qui souhaitent déterminer le flux moléculaire en deux dimensions dans les cellules vivantes, à partir de données acquises à des résolutions spatiales au-delà de la limite de diffraction de la lumière.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

Filamenteuse-actine joue un rôle crucial dans la majorité des processus cellulaires, y compris la motilité et, dans les cellules immunitaires, la formation d&#39;une interaction cellule-cellule clé connue sous le nom de la synapse immunologique. F-actine est également supposé jouer un rôle dans la régulation des distributions moléculaires à la membrane des cellules, y compris la dynamique de vésicules sous-membraneuse et le regroupement des protéines. Bien que les techniques de microscope optique standard permettent observations généralisées et limitée par la diffraction à faire, de nombreux événements cellulaires et moléculaires, y compris le regroupement et le flux moléculaire se produisent dans les populations à longueur des échelles bien en dessous du pouvoir de résolution de la microscopie optique standard. En combinant totale fluorescence par réflexion interne à la résolution d&#39;imagerie procédé illumination structurée ultra microscopie, l&#39;écoulement moléculaire à deux dimensions de la F-actine à la synapse immunitaire des cellules T a été notée. Spatio-temporelle spectroscopie de corrélation d&#39;images (STICS) a ensuite été appliqué, ce qui génère resul quantifiablets sous la forme d&#39;histogrammes de vitesse et des cartes vectorielles représentant directionnalité de l&#39;écoulement et de l&#39;ampleur. Ce protocole décrit la combinaison de l&#39;imagerie et STICS techniques de super-résolution pour générer des vecteurs d&#39;écoulement au niveau de détail sous-diffraction. Cette technique a été utilisée pour confirmer un flux d&#39;actine qui est symétrique centripète rétrograde et tout au long de la périphérie des cellules T lors de la formation de la synapse.

Paramètres de microscope Après avoir atteint avec succès toutes les étapes le chercheur aura éclairage structuré accompli (SIM) Imagerie du flux F-actine dans une synapse des cellules T (vidéo 1), et quantifié ce flux moléculaire par spectroscopie corrélation d&#39;images spatio-temporelle (Figure 4 11). Avant d&#39;enregistrer des images, assurer l&#39;éclairage de l&#39;échantillon est...

Watch this Scientific Journal Video about Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data at JoVE.com

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K vues.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

Vidéo: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;utilisation de la cytométrie de flux pour évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Préparation des cellules CD4<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T pour l&#39;analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...