La microscopie à feuilles lumineuses en treillis est une puissante technologie d’imagerie, mais peu de laboratoires dans le monde sont capables de l’utiliser. Ce protocole donne un aperçu détaillé de la façon d’utiliser le microscope à feuilles lumineuses en treillis disponible dans le commerce. C’est un système extrêmement puissant capable d’imagerie quadridimensionnelle de cellules individuelles ou d’embryons qui permet un suivi en temps réel des molécules.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut en trois dimensions l’image de cellules ou d’organes vivants simples avec une résolution spatiotemporale élevée et un minimum de blanchiment photo. Le modèle de treillis de la feuille de lumière nous permet d’échantillons d’images à grande vitesse et d’obtenir des vidéos en temps réel de cellules vivantes tridimensionnelles et d’organes avec des détails moléculaires que d’autres techniques ne peuvent pas atteindre. Ce premier protocole vidéo montrant comment nous treillis microscopie feuille de lumière à l’image d’une seule cellule en quatre dimensions.
Il s’agit d’une technique très compliquée en raison de l’alignement et la préparation de l’échantillon. Et nous croyons que la démonstration visuelle améliorera l’accessibilité en permettant à plus de scientifiques d’image de nombreuses molécules, cellules et organes différents en biologie. Pour commencer cette procédure, incuber cinq millimètres de coverslips ronds avec 0,1% de poly-L-lysine à température ambiante pendant 10 minutes.
Aspirer le liquide et laisser sécher l’air des coverslips naturellement. Ensuite, ajoutez trois millilitres de gradient de densité à un tube conique de 15 millilitres. Ajouter délicatement les cellules drop-wise sur le bord du tube.
Centrifugeuse à 930 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, retirez soigneusement la fine couche moyenne des cellules entre le milieu complet et le réaccente de gradient de densité en vous assurant de mettre chaque type de cellule dans un tube conique séparé. Centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes pour laver les cellules.
Jetez le supernatant et ajoutez cinq millilitres de RPMI aux tubes des cellules T et CH27. Répétez le lavage avec du RPMI frais jusqu’à ce que trois lavages totaux aient été effectués. Ensuite, resuspendez les cellules dans chaque tube avec un millilitre de RPMI complet et comptez les cellules avec un hémocytomètre.
Resuspendez un million de cellules présentant des antigènes dans 500 microlitres de RPMI complet et ajoutez 10 MCC micromolaires. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après cela, résuspendez un million de T-cellules dans 500 microlitres de RPMI complet.
Ajouter deux microgrammes d’anti-TCR bêta Alexa 488 étiqueté FAB et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, centrifuger les deux cellules à 300 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Ajouter 500 microlitres de RPMI complet et répéter la centrifugeuse pour laver les cellules.
Répétez le lavage avec rpmi frais jusqu’à ce que trois lavages totaux ont été effectués rejetant le supernatant après chaque lavage. Après cela, resuspendez les deux types de cellules dans 500 microlitres de médias d’imagerie. Tout d’abord, ajouter 10 millilitres d’eau et 30 microlitres de fluorescéine au bain LLSM.
Appuyez sur Image Accueil pour déplacer l’objet vers la position de l’image et regarder un seul modèle de faisceau laser Bessel. Alignez le faisceau laser à l’aide du guide et prédéfinir la région d’intérêt pour faire du faisceau un motif mince qui est équilibré dans toutes les directions. Le faisceau doit également apparaître concentré dans la caméra de recherche.
Utilisez les deux ajusteurs d’inclinaison du miroir, le micromètre de mise au point supérieur et la couleur objective pour régler le faisceau. Ensuite, lavez le bain et les objectifs avec au moins 200 millilitres d’eau pour éliminer complètement toute fluorescéine. Pour l’image des perles fluorescentes standard, allumez le tramage en fixant à trois dans la boîte de gamme Xgalvo et appuyez sur Live pour voir le champ actuel.
Ajustez manuellement le miroir d’inclinaison, la couleur objective et le micromètre de mise au point pour les valeurs grises les plus élevées. Ensuite, ajustez au besoin pour obtenir des modèles appropriés pour l’analyse objective, Z galvo, Z plus objectif, et les modes de capture d’analyse d’échantillon. Après cela, appuyez sur Exécuter en mode analyse d’échantillon pour recueillir la fonction de propagation de point d’échantillon pour le dé-biaisage et la dé-convolution.
Changez les lasers en mode trois couleurs et appuyez à nouveau Exécuter à nouveau. Pour commencer, ajoutez 100 000 cellules anti-présentation à la couverture circulaire préparée de cinq millimètres de diamètre et laissez-leur se contenter de 10 minutes. Graisser le support de l’échantillon et ajouter le coverslip sur le côté cellulaire vers le haut.
Ensuite, ajoutez une goutte de supports d’imagerie à l’arrière du coverslip. Vissez le porte-échantillon sur le Piezo et appuyez sur Image Home. Trouvez une cellule présentant des antigènes à l’image et assurez-vous que le LLSM et le logiciel d’imagerie fonctionnent correctement.
Appuyez en direct pour afficher l’image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver le coverslip et les cellules. Trouvez le centre d’une cellule présentant des antigènes en vous déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Arrêter pour mettre le laser en pause.
Vérifiez la 3D et entrez les paramètres souhaités. Centre de presse, puis appuyez sur Exécuter pour recueillir les données. Abaissez la scène à la position de charge et ajoutez 50 microlitres de T-cells et de supports d’imagerie drop-wise directement sur le coverslip.
Il est préférable de laisser une goutte se former à l’extrémité de la pointe pipette, puis toucher la pointe vers le liquide du bain. Remontez la scène en cliquant sur Retour d’image. Commencez l’imagerie.
Assurez-vous de définir la pile Z désirée et la longueur timelapse. Par exemple, l’image 60 Z s’empile à une taille d’étape de 0,4 micromètre et entre 500 délais. Arrêtez d’enregistrer avant que 500 images ne soient atteintes pour éviter le blanchiment des photos.
Utilisez le mode live pour rechercher des paires de cellules et lorsque les paramètres prêts et désirés ont été entrés, appuyez sur Exécuter pour collecter des données. Dans cette étude, les cellules T 5CC7 de souris primaires sont isolées et préparées et sont ensuite photographiées à l’aide d’un microscope à feuilles lumineuses en treillis. Montré ici sont le chemin de faisceau correct et l’alignement du faisceau lorsqu’il est représenté avec de la fluorescéine.
L’analyse objective doit montrer une grande forme X dans les projections XZ et YZ qui est aussi symétrique que possible. Ils doivent également être ajustés pour être aussi petits qu’un X que possible. Le scan Z galvo doit montrer un ovale en XZ et XY avec un seul point de chaque côté.
Enfin, l’analyse objective Z plus et l’analyse de l’échantillon doivent montrer des points qui semblent aussi ronds que possible. À l’aide de ce protocole, on a pu voir la dynamique quadridimensionnelle des récepteurs des cellules T à la surface des cellules T. Le principal avantage de ce microscope réside dans la capacité de suivre les unités de surface visualisées des récepteurs des cellules T et d’obtenir des données quantifiées de leur taille, mouvement, intensité du signal et excréments.
La chose la plus importante à retenir est la qualité de votre alignement. La feuille de lumière en treillis doit être alignée quotidiennement et ne pas le faire correctement entraînera une imagerie déformée. De même, la qualité du PSF collecté a un impact direct sur la qualité de la dé-convolution qui aboutt finalement à la qualité de votre image finale.
Une des raisons pour lesquelles cette méthode est si puissante est parce que chaque cellule et étiquette peut être remplacée pour visualiser de nombreux types de cellules et molécules. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour répondre à toute question liée au suivi quadridimensionnel des molécules. Nous pensons que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions dans le domaine du trafic moléculaire.
Il n’est pas encore largement utilisé en raison du système compliqué, donc nous espérons que cette vidéo Jove permettra d’améliorer l’accessibilité à la technique. Les lasers utilisés sur le système sont de classe quatre, donc une prudence absolue doit être prise pour assurer la sécurité laser. S’il vous plaît prendre la formation nécessaire à la sécurité laser avant d’utiliser cette méthode.
