Ce protocole est important en raison de la simplicité de la plate-forme de capteurs TGT utilisée pour étudier la diaphonie EGFR-intégrine et de son influence sur les forces mécaniques des cellules. Rao a étudié la régulation de la mécanique cellulaire dépendante de l’EGF. Le protocole est adaptable à différents ligands, types de cellules, paradigmes de stimulation, et peut être couplé avec des TGT de différents seuils de tension.
La synthèse de surface peut sembler intimidante au début. La clé est d’être préparé et organisé pour exécuter avec précision les étapes complexes en utilisant une liste de contrôle pour la préparation et les calculs des réactifs. Le premier jour, placez jusqu’à huit couvercles en verre de 25 millimètres glissés dans un rack en polytétrafluoroéthylène.
Placez le rack dans un bécher en borosilicate de 50 millilitres contenant 40 millilitres d’éthanol à 200 degrés. Sonicate à une fréquence de fonctionnement de 35 kilohertz pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Remplir un bécher de 50 millilitres avec 40 millilitres de solution de piranha fraîchement préparée en mélangeant de l’acide sulfurique et du peroxyde d’hydrogène dans un rapport de 3:1 dans un bécher en pyrex et en remuant avec une pipette en verre.
Transférer le porte-couvercle dans le bécher et incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans la hotte pour graver la surface du couvercle. Après la gravure, transférer le porte-housse dans un bécher avec de l’eau ultrapure avec une pince à épiler. Inspectez visuellement les glissières de couverture pour vous assurer que les surfaces ont l’air propres sans motifs ni particules de poussière sur la surface du verre.
Transférer le porte-bagages de couverture dans un bécher avec de l’éthanol résistant à 200 et laver deux fois pendant 15 secondes pour équilibrer les surfaces en solvant organique. Transférer le porte-couvercle dans une solution d’éthanol à 200 épreuves avec 3% APTES pendant une heure à température ambiante pour silaniser les glissières de couverture. Plongez le rack dans un bécher propre avec une solution d’éthanol résistante à 200.
Sécher les glissements du couvercle à l’aide d’azote gazeux à faible pression de sortie. Placez le couvercle glissé dans un plat en polystyrène de 10 centimètres avec un morceau de film de parrafine posé à plat à l’intérieur. Ajouter 100 microlitres de deux milligrammes par millilitre de solution de NHS-biotine dans du DMSO à quatre bordereaux de couverture placés sur un film de paraffine.
Placez un sandwich avec les quatre autres glissières de couverture sur le dessus, avec deux glissières de couverture tournées l’une vers l’autre avec la solution de fonctionnalisation entre les deux. Le deuxième jour, retirez le plat de quatre degrés Celsius et séparez les feuillets de couverture en sandwich. Évitez de rayer ou d’endommager la surface fonctionnalisée tout en séparant le sandwich.
Ensuite, orientez les glissières de couverture dans le rack avec la surface revêtue l’une en face de l’autre. Sécher avec de l’azote gazeux. Placez les couvercles glissés dans un nouveau plat avec un film de parrafine à l’intérieur.
Ajouter 800 microlitres d’albumine sérique bovine à 0,1 % dans 1X PBS à chaque bordereau de couverture. Incuber les glissements de couverture à température ambiante pendant 30 minutes pour passiviser la surface et bloquer la liaison non spécifique des réactifs de fonctionnalisation ultérieurs. Pour fonctionnaliser les feuillets de couverture, ajoutez 800 microlitres d’un microgramme par millilitre de streptavidine dans 1X PBS à température ambiante pendant 45 à 60 minutes.
Assemblez les sondes TGT dans un tube PCR à l’aide d’un thermocycleur. Après l’incubation, lavez les couvercles trois fois avec 1X PBS. Ajoutez 100 microlitres des sondes TGT préassemblées à quatre glissières de couverture et faites des sandwichs en utilisant les quatre glissières de couverture restantes avec le côté fonctionnalisé faisant face aux sondes.
Couvrir avec du papier d’aluminium. Après l’incubation, séparez les sandwichs et lavez les couvercles avec 1X PBS trois fois. Assemblez soigneusement les couvercles glissés dans des chambres d’imagerie pré-nettoyées.
Pour étudier l’effet de la stimulation du facteur de croissance épidermique sur la mécanique du Cos-7, l’adhérence et la propagation cellulaire, trypsiniser les cellules Cos-7 avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant deux minutes. Neutraliser la trypsine en la lavant avec HBSS et en centrifugant à 800 G pendant cinq minutes. Cellules de plaque à une densité de 40 000 cellules sur les surfaces TGT assemblées en DMEM complétées par 50 nanogrammes par millilitre EGF ou DMEM sans EGF.
Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec 1X PBS. Fixer avec deux millilitres de 4% de paraformaldéhyde pendant 12 minutes à température ambiante. Lavez le couvercle cinq fois avec 1X PBS à intervalles de cinq minutes à température ambiante.
En option, incuber les couvercles avec du chlorure d’ammonium de 50 millimolaires dans 1X PBS pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter le tampon A et placer les chambres d’imagerie avec couvercle dans un récipient d’humidité. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour bloquer et perméabiliser les cellules.
Diluer l’anticorps anti-paxilline primaire à des dilutions de 1:250 dans un tampon bloquant. Incuber avec 200 microlitres de solution d’anticorps primaires par couvercle pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Étiqueter les cellules simultanément avec un mélange d’anticorps secondaires di-conjugués chèvre/anti-lapin à une dilution de 1:800 et de phalloïdine di-conjuguée à des dilutions de 1:400 dans 200 microlitres de tampon bloquant par glissement de couverture.
Lavez les surfaces cinq fois avec 1X PBS à des intervalles de cinq minutes. Pour commencer, ajoutez de l’huile à l’objectif, nettoyez le fond du couvercle de la chambre d’échantillonnage et placez l’échantillon sur la scène. Concentrez-vous sur une cellule et engagez la concentration parfaite.
Alignez le RICM en fermant et en centrant le diaphragme d’ouverture de l’épi-éclairage. Concentrez le laser de 488 nanomètres sur un petit point au plafond de la pièce et augmentez l’angle d’incidence jusqu’à ce qu’il dépasse l’angle critique, tout en surveillant la fluorescence sur la caméra en mode direct. Observez une forte réduction de la fluorescence de fond et un seul plan de mise au point lorsque l’angle critique est dépassé.
Identifiez les cellules pour l’imagerie à l’aide du mode en direct de la caméra à l’aide de RICM. Acquérir les images RICM et TIRF de l’actine à une excitation de 488 nanomètres, d’une tension d’intégrine à une excitation de 561 nanomètres et de la paxilline à une excitation de 647 nanomètres. Obtenez des images séquentiellement en utilisant un temps d’exposition de 200 millisecondes.
Changez les bordereaux de couverture, faites la mise au point et répétez. Les cellules Cos-7 ont été plaquées sur cette surface TGT avec ou sans stimulation EGF pour étudier l’impact de l’activation de l’EGFR avec stimulation par ligand sur la mécanique de l’intégrine. Si une intégrine lie le ligand et applique une force supérieure au seuil de tension total de la sonde, le duplex de l’ADN se séparera, conduisant à la fluorescence.
Toute sonde TGT dont une force mécanique ne s’est pas rompue restera non fluorescente. Les cellules ont été incubées avec ou sans EGF sur les surfaces TGT pendant 60 minutes, fixées et immunocolorées pour afficher la distribution de l’adhésion focale et l’organisation du cytosquelette. Dans l’image RICM, l’étalement de cellules Cos-7 sur la surface du TGT 56-piconewton a été significativement amélioré avec la stimulation EGF par rapport à sans stimulation.
La stimulation par l’EGF a entraîné une morphologie plus circulaire, représentant la propagation et la croissance des cellules Cos-7. La fluorescence des sondes ouvertes est également plus élevée avec la stimulation EGF, comme on l’observe dans l’image de fluorescence de tension. L’intensité intégrée des sondes ouvertes proportionnelle au nombre de sondes ouvertes était beaucoup plus élevée avec la stimulation EGF que sans stimulation.
Rappelez-vous toujours l’orientation des glissières de couverture, en gardant la surface fonctionnalisée tournée vers le haut. Lorsque vous séparez le sandwich, soyez doux pour que la surface ne soit pas rayée ou endommagée. Après la synthèse de surface, on peut sonder les protéines cytoplasmiques régulant l’adhésion cellulaire ou la transduction mécanique.
Cela permet d’identifier les molécules de signalisation en aval impliquées dans l’orchestration de la mécanique cellulaire au niveau de la membrane plasmique.
