Name: measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

1. Préparation des aliments contenant des Fly radiomarqués métaboliques Substrats <ol><li> Dans un tube de microcentrifugeuse, mélanger 1 - 2 uCi substrat radiomarqué (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] -glucose ou [1- 14 C] acide -palmitic, 40 - 60 mCi / mmol) avec 15 ul FD &amp; C n ° 1 colorant bleu alimentaire et H 2 O à l&#39; égalité d&#39; un volume total de 25 ul. ATTENTION: Le carbone 14 est un émetteur bêta de faible énergie et a une courte distance dans l&#39;air. Cependant, prendre soin de ne pas renverser de molécules radiomarquées ou ingestion accidentelle par l&#39;expérimentateur. Fly flacons alimentaires basculent facilement; assurez-vous de les loger dans un conteneur qui les empêche de basculer, en particulier lorsque radiomarqueur est sous forme liquide (étape 1.2) ou dans les aliments non solidifiée (étape 1.4). Les mouches qui sont nourris ou ont été nourris substrats radiomarqués va commencer à expirer de petites quantités de CO 2 radiomarqué. Ces mouches doivent être conservés dans des boîtes acryliques dans les hottes, et un petit plat de KOH can être défini dans la boîte pour être utilisé comme un épurateur de CO 2. </li><li> Pipet tout le substrat radiomarqué et colorant bleu mélange dans le fond d&#39;une mouche flacon alimentaire vide (hauteur: 9,4 cm, largeur: 2,2 cm). </li><li> norme de chaleur voler la nourriture dans un four à micro-ondes jusqu&#39;à ce que la nourriture est tout simplement liquéfié (15-20 sec au niveau de puissance élevé pour un flacon contenant 10 ml de nourriture). </li><li> Ajouter la nourriture 975 ul fondue au substrat radiomarqué / colorant bleu mélange et rapidement tourbillonner, le suivi uniformité de la couleur bleue pour assurer un mélange complet. </li><li> Laissez les aliments refroidir et se solidifier complètement à température ambiante pendant 20 - 30 min. </li></ol> 2. Alimentation Substrats radiomarqué métaboliques à mouches adultes fruits <ol><li> Anesthésier les mouches adultes en utilisant un appareil anesthésiant CO 2 constitué par le polyéthylène poreux fusionné à base d&#39; acrylique et relié à un réservoir de CO 2 avec un régulateur de pression. L&#39; écoulement du CO 2 dans l&#39;appareil anesthésiant à 5 L / min. <ol><li> Transfert Anesthetized vole dans des flacons contenant radiomarqués, alimentaires teints en bleu (n = 15 - 30 mouches par flacon). flacons de Cap avec un bouchon en mousse, et se reposer horizontalement jusqu&#39;à ce que les mouches se réveillent. flacons de transfert à un récipient acrylique lidded (180 cm x 180 cm x 240 cm de haut). </li></ol></li><li> Pour l&#39; alimentation à court terme, mourir de faim mouches pendant 18 - 24 heures avant le transfert de mouches à la nourriture radiomarqué pour un 2 -. Étape 3 h d&#39;avance T qu&#39;il étape de la famine est important parce que les mouches nourries ne mangent pas de manière fiable une nouvelle source de nourriture qui leur est présentée . Pour l&#39;alimentation à long terme au cours de 5 - 7 jours, les mouches ne doivent pas être privés de nourriture, mais l&#39;expérimentateur doit surveiller la teneur en eau de la nourriture radiomarqué dans les flacons mouches sont logés dans et utiliser une aiguille et une seringue pour ajouter de l&#39;eau dans des flacons avec de la nourriture sèche. </li><li> Transfert vole à la nourriture non marquée par «tapping» dans un nouveau flacon. Une période de chasse initiale de 2-4 h permet mouches pour nettoyer les particules de nourriture radiomarqués de leurs cuticules et permet la digestion des radiomarqueured nourriture restante dans l&#39;intestin. Surveiller les progrès des aliments dans l&#39;intestin par une inspection visuelle des mouches pour chercher abdomens bleu. </li><li> Par la suite, le transfert vole vers différents types d&#39;aliments (12-24 de h sur la nourriture standard ou 1% de gélose pour la mesure des effets de la nourri par rapport à jeun sur la respiration) ou à des températures ambiantes (12-96 h à 18 ° C ou 30 ° C pour génétique manipulations utilisant GAL80 sensible à la température (GAL80 ts), par exemple). Remarque: La durée de cette période de chasse varie en fonction de l&#39;expérience effectuée. Pour exemple, une poursuite de 96 heures à 30 ° C peut être nécessaire dans des expériences utilisant des GAL80 ts afin d&#39;activer complètement l&#39; expression du transgène GAL4-dépendante. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;appareil CO 2 -Collection <ol><li> Assembler des matériaux pour la construction de &quot;voler pods&quot;, des tubes de treillis-capped qui contiendra les mouches marquées avec 14 C-glucose ou 14 C-acide palmitique et that restera ouvert à l&#39;atmosphère. Coupez le top 50 mm de 12 mm de tubes en polypropylène x 75 mm, ce qui laisse 25, des tubes à fond rond mm de long. Préparer 35 mm x 35 mm carrés de 130 um maille de nylon. En outre, obtenir du ruban adhésif transparent dans un distributeur de ruban adhésif. </li><li> Assembler des matériaux pour les CO 2 appareils de -Bureaux. Pour chaque pod voler, assembler un 20 ml à scintillation en verre du flacon, un top bouchon en caoutchouc avec un trou excentré, un centre de bien être inséré à travers le trou dans le bouchon supérieur, GF grade / B papier filtre en microfibres de verre (2,1 cm de diamètre cercle, 1 um pore). / B papier filtre GF est utilisé en raison de sa résistance à l&#39;humidité élevée et la capacité de charge élevée. </li><li> Préparer 5% de KOH fraîches le jour de l&#39;utilisation. Juste avant l&#39;étape 3.4, plier et placer le papier circulaire de filtre GF / B dans le centre de bien qui est filetée à travers le trou de la partie supérieure bouchon en caoutchouc et le saturer avec 100 ul de 5% de KOH. Reportez - vous à la figure 1. </li><li> Après incubation (s) sur un support non marqué, unnesthetize vole avec CO 2. Brush vole dans le tube de coupure de polypropylène, bouchon avec filet de nylon, et utiliser du ruban adhésif transparent pour adhérer au maillage tube. Travaillez rapidement pour éviter les mouches se réveiller et d&#39;échapper avant que le maillage a été solidement fixé sur le tube. Un nombre égal de mouches doit être utilisé dans chaque gousse de mouche pour une expérience particulière; 10 - 20 mouches par mouche pod produisent suffisamment radiomarqué-CO 2 pour la mesure par comptage de scintillation (étape 4.1 ci - dessous). </li><li> Transférer le pod de mouche à 20 ml à scintillation en verre du flacon. Boucher le flacon en verre avec la partie supérieure du bouchon en caoutchouc tenant un centre de bien contenant du papier filtre GF / B KOH saturé. Pliez le large en haut de la partie supérieure du bouchon en caoutchouc sur la lèvre du flacon à scintillation en verre. Reportez - vous à la figure 1. </li><li> flacons en verre Set contenant les mouches dans un couvercle, récipient acrylique, et incuber pendant différentes périodes de temps (2 à 12 h fonctionne bien). </li></ol> 4. Analyse des résultats <ol><li> Àla fin de l&#39;incubation, des flacons en verre décapsuler, et un papier filtre GF / B de KOH saturé transfert dans un flacon à scintillation en plastique de 6 ml contenant 4 ml de cocktail de scintillation. </li><li> Si nécessaire, congeler les mouches dans les gousses de mouches sur la glace sèche et conserver à -80 ° C pour la détermination ultérieure de substrats stockés. On notera que ces échantillons sont radioactifs et doivent être stockées en conséquence. </li><li> Préparer des flacons de scintillation supplémentaires: l&#39;un contenant / B papier filtre GF utilisé pour servir de fond et une à deux autres contenant de 0,1 à 0,5 uCi substrat radiomarqué pour déterminer cpm / uCi. </li><li> Mesurer cpm pour chaque échantillon en utilisant un compteur à scintillation selon le protocole du fabricant. </li><li> Calculer pmol 14 CO 2 / cpm et pmol 14 CO 2 par mouche par heure. Soustraire le cpm de fond à partir de la valeur cpm pour chaque échantillon. A partir des données nettes de substrat radiomarqués, calculer le cpm de fond corrigée / uCi de l&#39;échantillon compté. <ol><li> Utilisez lefourni par le fabricant activité spécifique et de la concentration radiochimique du substrat radiomarqué (par exemple, 50 uCi / umole et 0,1 pCi / pl, respectivement) pour calculer pmol / cpm. Utilisez ce facteur pour convertir les données mouche pod fond corrigée de cpm 14 CO 2 / échantillon pmol 14 CO 2 / échantillon. Puis diviser par le nombre de mouches et le nombre d&#39;heures dans la nacelle à la mouche. </li></ol></li></ol>

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The author declares no competing financial interests.

Ce protocole décrit un procédé pour mesurer l&#39;oxydation des substrats spécifiques radiomarqués chez les adultes de Drosophila melanogaster. Cette technique est simple, quantitative, reproductible et sensible, et il vient compléter les méthodes existantes qui mesurent la production totale de CO 2 et O 2 consommation , car il peut être utilisé pour identifier l&#39;élément nutritif (s) est oxydé pour la production d&#39;ATP. Mesure du CO 2 libérée par l&#39;oxydation de substrats radiomarqués spécifiques en utilisant la méthode décrite ici est complémentaire des techniques qui mesurent la production totale de CO 2. CO Total 2 production (V CO2) permet d&#39; estimer le taux métabolique et, si le montant total O 2 Consommation (V O2) est connu, le taux métabolique peut être calculé et la source de combustible pour l&#39; oxydation peut être estimée sur la base du ratio d&#39;échange respiratoire (V CO2 / V O2 = RER). Quandles hydrates de carbone sont le substrat exclusif, RER = 1, mais lorsque les acides gras sont la source exclusive, RER = 0,7, grâce à la stoechiométrie des réactions de glucose et de l&#39;oxydation des lipides. En l&#39;absence d&#39;équipements pour mesurer la consommation d&#39;oxygène chez la drosophile 14, la source de combustible oxydant ne peut être identifié. Cependant, par l&#39; étiquetage vole avec des quantités infimes d&#39;un substrat radioactif ou d&#39;une autre et les taux de mesure de radiomarqué production de CO 2, on peut tirer des conclusions quant à la capacité des mouches pour oxyder un substrat donné à différents moments au cours d&#39; un stimulus ou sur les effets d&#39;une étant donné la mutation sur l&#39;oxydation du carburant. Il y a un certain nombre d&#39;étapes critiques dans ce protocole. Tout d&#39;abord, il faut prendre soin lors de l&#39;utilisation des matières radioactives pour éviter les déversements et la contamination des zones de recherche. Deuxièmement, lorsque anesthésier les mouches pendant les étapes 2.1 et 3.4, l&#39;expérimentateur doit travailler rapidement pour éviter les effets de CO 2 prolongéel&#39;exposition sur le métabolisme et le comportement. Un groupe de 20 mouches peut être anesthésiée et transféré dans un nouveau flacon ou dans une nacelle de braguette en 20 secondes ou moins. Lorsqu&#39;ils sont transférés d&#39;un appareil d&#39;anesthésie à un flacon alimentaire, le flacon doit être posé sur le côté pour empêcher les mouches anesthésiées de se coincer sur la surface des aliments. Quand les mouches sont des aliments radiomarqué nourris au cours de plusieurs jours comme dans l&#39;étape 2.2, l&#39;expérimentateur devrait assurer que la nourriture ne se dessèche pas que les mouches sont sensibles à la déshydratation. L&#39;état nourri ou à jeun avant l&#39;étiquetage, le choix de l&#39;étiquette, la longueur du temps d&#39;étiquetage, la longueur de temps dans la nacelle à la mouche, et la méthode de l&#39;anesthésie sont des paramètres qui peuvent être soumis au dépannage et à la modification lors de l&#39;utilisation de cette technique. Tout d&#39;abord, les mouches soumis à des périodes d&#39;étiquetage courtes (2 - 3 hr) ne sont pas susceptibles de consommer des quantités importantes de nourriture radiomarqué moins soumis à une période de jeûne préalable. D&#39;autre part, le choix du marqueur cune incidence sur les conclusions que l&#39;on peut tirer sur les phénotypes métaboliques. Par exemple, la production de CO 2 radiomarqué à partir de D- [1- 14C] -glucose peut refléter l&#39; oxydation par le cycle de l&#39; acide citrique ou du phosphate pentose, alors que la production de CO 2 radiomarqué à partir D- [6- 14C] -glucose reflète l&#39; oxydation à travers le cycle de l&#39; acide citrique seul 12,15,16. Nourrir les mouches avec un traceur radiomarqué pour un acide aminé essentiel 17,18 serait une bonne stratégie pour évaluer l&#39; oxydation des acides aminés dérivés de protéines. Enfin, les périodes longues de marquage avec du glucose radiomarqué soulèvent également la possibilité d&#39;incorporation de ce précurseur dans d&#39; autres classes de molécules telles que les triglycérides 19 et des acides aminés tels que l&#39; alanine, qui interconvertit facilement avec du pyruvate. Elle peut être évaluée en mesurant la radioactivité incorporée dans les différentes classes de molécules 6. rad En effet, des cohortes distinctes de mouches peuvent être nourrissubstrats iolabeled de la même manière et ensuite utilisé pour des expériences mouche pod ou la mesure de radiomarqueur qui sont stockées et reste en glycogène et de triglycérides dans nourris et jeûné conditions 6, par exemple. Une autre stratégie consiste à utiliser de courtes périodes d&#39;étiquetage qui sont susceptibles de révéler l&#39;oxydation des nutriments alimentaires radiomarqués eux-mêmes et non pas des formes de stockage de ces nutriments. Troisièmement, il est également possible que deux groupes de mouches pourraient avoir des taux identiques de 14 production de CO 2 sur une période de temps donnée, mais des vitesses très différentes au départ. Par conséquent, faire varier la quantité de temps qui vole passer dans la nacelle de mouche peut être un paramètre important de modifier l&#39;évaluation de la variation phénotypique. Enfin, ce protocole prévoit l&#39;utilisation d&#39;une courte période de CO 2 anesthésie lors de la mise mouches dans l&#39;appareil mouche pod. Il est possible que les CO 2 anesthésie peuvent affecter la fonction métabolique au cours de l&#39;expérience mouche pod. Un suppléant approche est d&#39;utiliser l&#39; anesthésie d&#39;azote qui ne modifie pas le taux métabolique 20. Comme avec toute technique qui mesure un système aussi complexe que l&#39;oxydation du carburant et le taux métabolique, le procédé décrit ici a des limites. Tout d&#39; abord, il est possible que les mouches dans les différents groupes pourraient consommer différentes quantités de nourriture radiomarqué et ne serait donc entrer dans la phase de collecte de CO 2 de l&#39;essai avec différentes quantités de départ de substrat. Ceci peut être contrôlé par une certaine mesure en effectuant l&#39;expérience avec de grandes tailles d&#39;échantillon et en alimentant les mouches en masse. Pour les périodes d&#39;étiquetage courtes, les mouches avec les tripes de couleur bleue similaires auront consommé radiomarqueur et peuvent être reportés à la partie de chasse de l&#39;expérience. La quantité de radiomarqueur restant dans un groupe de mouches peut également être mesurée à la fin de l&#39;expérience et des cohortes distinctes de mouches après la fin de l&#39;alimentation et de la période de chasse initiale. Deuxièmement, les niveaux d&#39;activité entregroupes de mouches dans les gousses de mouches peuvent différer. Cela devra être déterminée expérimentalement et pris en compte lors de l&#39;interprétation des données. Troisièmement, cette technique ne permet pas de mesurer la production totale de CO 2, seule la production d&#39;un nutriment alimentaire spécifique ou la forme (s) de stockage de ce nutriment. Ce protocole ne remplace pas pour mais est complémentaire aux mesures de VCO 2 , car il fournit des informations différentes et complémentaires. La méthode décrite ici mesures exhalé, CO 2 radiomarqué qui est un produit de l&#39;oxydation des quantités infimes de substrats métaboliques spécifiques. En faisant varier l&#39;étiquette utilisée - glucose, acides gras ou acides aminés - on peut concevoir des expériences de plus en plus sophistiqués pour évaluer les contributions des différents substrats du métabolisme dans différentes conditions physiologiques telles que la famine et sur différents fonds génétiques. Les applications futures de cette technique comprennent la mesure de METABOLIm dans les stades larvaires et pupes de développement, deux étapes du cycle de vie de Drosophila qui sont caractérisées par des extrêmes de stockage des éléments nutritifs et la ventilation, respectivement.

Le travail dans l&#39;organisme modèle Drosophila melanogaster a grandement contribué à la compréhension des principes de la génétique, les processus de développement, la croissance, le vieillissement, le comportement, l&#39; immunité et la maladie humaine 1,2. Une myriade d&#39;approches biologiques génétiques et cellulaires chez la drosophile a entraîné des progrès dans ces domaines. Cependant, l&#39;étude du métabolisme de la mouche des fruits a développé plus lentement, en grande partie grâce à des difficultés dans la mesure des paramètres métaboliques dans un si petit animal. L&#39;intérêt d&#39;utiliser la drosophile comme modèle pour l&#39; étude des maladies humaines telles que le diabète et pour comprendre les contributions du métabolisme à des pathologies de croissance et divers a poussé le terrain pour développer et adapter les techniques métaboliques pour cet organisme 3,4. Des méthodes fiables sont maintenant disponibles pour la mesure d&#39;un certain nombre de paramètres métaboliques dans la mouche des fruits. Par exemple, il est facile d&#39;évaluer l&#39;apport alimentaire <sup&gt; 5, les niveaux de triglycérides stockés et du glycogène, ainsi que les taux circulants de glucose hémolymphe et le principal sucre circulant dans la mouche, le trehalose, qui est un disaccharide constitué de deux molécules de glucose 4. L&#39; utilisation de traceurs métaboliques a permis l&#39;étude de l&#39; absorption des nutriments dans l&#39;alimentation et la conversion des nutriments absorbés tels que le glucose à la forme de stockage du glycogène et de triglycérides 6. Les taux métaboliques peuvent être évalués dans le fruit voler à travers la mesure de la consommation d&#39;oxygène 7,8 et de dioxyde de carbone (CO 2). Le cycle de l&#39;acide citrique deux unités oxyde de carbone qui peuvent entrer dans le cycle en tant que coenzyme acétyle A (CoA), qui est dérivé du métabolisme des glucides alimentaires et stockés et les acides gras. Chaque tour du cycle génère une molécule chacun des GTP (ou ATP) et le donneur d&#39;électrons FADH 2, trois molécules de NADH, et deux molécules du CO produit des déchets 2. Production de CO 2 peutêtre utilisé pour estimer le taux de métabolisme de base. La production totale de CO 2 peut être quantifiée chez la drosophile par l&#39;utilisation de disponibles dans le commerce ou à la main respiromètres 9-10,11. La mesure de la production totale de CO 2, en particulier lorsqu&#39;elle est associée à la mesure de consommation d&#39; O 2, fournit des informations précieuses sur le métabolisme énergétique du corps entier. Toutefois, cette mesure ne permet pas d&#39;identifier le nutriment oxydé pour l&#39;adénosine triphosphate (ATP). Trois grandes classes de nutriments peuvent entrer dans le cycle de l&#39;acide citrique conversion suivante en acétyl CoA: hydrates de carbone, des acides gras et des protéines. Glucose-6-phosphate, le dérivé de glucose alimentaire ou de glycogène, peut être converti en pyruvate est décarboxylé en pyruvate déshydrogénase pour former l&#39;acétyl-CoA. Dégradation des acides gras dérivés de l&#39;alimentation ou de triglycérides stockés par des rendements de ß-oxydation, l&#39;acétyl-CoA qui pénètre ensuite dans le cycle de l&#39;acide citrique. finalementUne majorité des acides aminés peut entrer dans le cycle de l&#39;acide citrique après conversion en pyruvate, l&#39;acétyl-CoA ou de l&#39;acide citrique intermédiaires du cycle tels que l&#39;alpha-cétoglutarate. apport spécifique de substances nutritives pour le métabolisme énergétique en conditions basales et stimulées peut être contrôlée par l&#39;utilisation de traceurs radioactifs. Le protocole présenté ici est adapté pour être utilisé dans Drosophila à partir d&#39; un protocole utilisé pour évaluer l&#39; oxydation dans les cellules cultivées en culture 12,13. Dans cette approche, les mouches des fruits sont nourris 14 substrats C-radiomarquée métaboliques (glucides, acides gras ou acides aminés) dans le régime alimentaire pour un court (heures) ou longues (jours) impulsion, chassés sur les aliments sans étiquette, puis exposés à un la chambre contenant de l&#39; hydroxyde de potassium (KOH) , du papier filtre saturé en CO exhalé pour le piégeage 2 sous forme de bicarbonate. bicarbonate radiomarqué peut être quantifiée par comptage par scintillation. Les différences de radiomarqué-production de CO 2 entre l&#39; expériencegroupes al de mouches peuvent refléter l&#39;utilisation de différents combustibles pour la production d&#39;ATP au cours d&#39;une des différences intrinsèques rapides ou prolongées dans le métabolisme de carburant entre les génotypes, par exemple.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

La puissance de la génétique de Drosophila est de plus appliquée aux questions de la signalisation hormonale et le métabolisme et le développement de modèles de maladies humaines dans cet organisme. Des méthodes sensibles pour la mesure de paramètres tels que les taux métaboliques sont nécessaires pour conduire la compréhension de la physiologie et de la maladie chez les petits animaux tels que la mouche des fruits. La méthode décrite ici évalue l&#39; oxydation du carburant dans un petit nombre de mouches adultes nourris avec des aliments contenant des quantités infimes de 14 substrats de carbone marqué tels que le glucose ou un acide gras. Après la période d&#39;alimentation et toutes les manipulations expérimentales supplémentaires, les mouches sont transférés dans des tubes courts coiffés de maille, qui sont ensuite placés dans des flacons en verre contenant du papier filtre de KOH saturé qui emprisonne exhalé, CO radiomarqué 2 produite à partir de l&#39; oxydation des substrats radiomarqués comme le bicarbonate de potassium, KHCO 3. Ce bicarbonate radiomarqué est mesurée par comptage par scintillation. Ceci est aqapproche QUANTITATIVE, reproductible et simple pour l&#39;étude de l&#39;oxydation du carburant. L&#39;utilisation du glucose radiomarqué, des acides gras, ou des acides aminés permet de déterminer la contribution de ces sources de carburant différentes pour le métabolisme énergétique dans des conditions différentes telles que l&#39;alimentation et le jeûne et dans différents contextes génétiques. Cela vient compléter d&#39; autres approches utilisées pour mesurer dans le métabolisme énergétique vivo et devrait favoriser la compréhension de la régulation métabolique.

La quantité d&#39;exhalé et piégés CO 2 radiomarqué qui est produite par le métabolisme d&#39;un substrat radioactif doit être en corrélation avec le nombre de mouches dans une nacelle volante ainsi que la quantité de temps que les animaux passent dans l&#39;appareil de collecte de CO 2. Pour tester cela, les mouches qui ont jeûné pendant 18 heures ont été nourris avec l&#39; acide palmitique radiomarqué (0,02 uCi / alimentaire ul) pendant 2 heures puis testées pour le CO radiomarqué 2 production dans des groupes de 12 ou 25 animaux pendant 3 ou 6 incubations h. La quantité de CO 2 produite par 25 mouches était presque le double de la quantité produite par 12 mouches, et le montant pour chaque groupe a doublé lorsque le temps d&#39;incubation a été augmentée de 3 h à 6 h (figure 2A). Le pmol 14 CO 2 / fly / h était à peu près équivalente dans chaque groupe. Le jeûne stimule la dégradation des acides gras par ß oxidation; par conséquent , la production de CO 2 à partir de l&#39; oxydation des acides gras doit être élevée chez les animaux à jeun par rapport aux animaux nourris. Pour déterminer si tel était le cas, de 18 h à jeun mouches ont été nourris avec l&#39;acide palmitique radiomarqué pendant 2 heures. Suite à cette impulsion d&#39;alimentation à court, les mouches ont été divisés en deux groupes et transférés à la nourriture à la mouche sans étiquette ou 1% d&#39;agar pendant 3 heures, puis transférés à voler gousses pendant 2 heures. Dans deux expériences distinctes, les mouches chassé sur gélose produit CO significativement plus radiomarqué 2 par rapport aux mouches chassés sur les aliments (figure 2B), ce qui indique que l&#39; oxydation ß a augmenté chez les animaux à jeun. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;appareil pour collecter exhalé, radiomarqué CO 2. Les mouches qui ont consommé des substrats métaboliques radiomarqués sontplacé dans un &quot;pod fly&quot; (FP), un tube de coupure de centrifugeuse plafonné à mailles (M). La nacelle volante est placée dans un 20 ml à scintillation en verre du flacon et coiffé d&#39;un bouchon de bouchon en caoutchouc (S) contenant un trou décentré, à travers lequel est placé un puits central (CW) qui contient un papier filtre GF / B saturé avec 100 ul 5% de KOH. Exhalée de CO 2 réagit avec le KOH et est piégé sur le papier filtre sous forme de bicarbonate. Pris au piège, CO 2 radiomarqué peut être quantifiée par comptage par scintillation de papier filtre saturé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figure 2. 14 CO 2 corrélats production avec le temps et le nombre de mouches dans unFly Pod et répond à la Fed et des conditions de jeûne. (A) La quantité de 14 CO 2 produit en vol alimenté palmitate radiomarqué est en corrélation avec le nombre de mouches testés (n = 12 (barres ouvertes) ou 25 (barres fermées)) et le temps passé dans une nacelle de mouche (3 ou 6 heures ). Sur une base par-mouche, mouches produites 0,99, 1,13, 1,10 et 1,01 pmol 14 CO 2 / h (données énumérées dans le même ordre de gauche à droite comme les données du graphique). (B) Les mouches qui ont été chassés sur gélose oxydée plus radiomarqué palmitate que les mouches qui ont été chassés de la nourriture. Les données proviennent de deux expériences et sont présentés en tant que moyen écart type, n = 16 - 17 mouches / groupe (expérience 1); n = 10 mouches / groupe (expérience 2). * P = 0,017, test t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K vues.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Vidéo: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochimie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurosciences

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Adaptation de la microrespirométrie à la drosophile - Aperçu du métabolisme des mutants CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Pleins feux sur l’auteur : Influence de la température sur Drosophila melanogaster et les coléoptères adaptés au désert 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Mesure de la consommation d’O2 chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en

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Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

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En direct de l'imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Dissection de Oenocytes d'adultes Drosophila melanogaster

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

Mesure des taux métabolique dans

Mesure de la consommation d’O₂ chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique