Les auteurs remercient Marin Manuel et Olivia Goldman-Szwajkajzer pour leur aide dans la prise des photos. Les auteurs remercient également Arjun Masukar et Tobias Bock pour la relecture du manuscrit. supports financiers ont été fournis par l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), le NIH-NINDS (R01NS077863), la Fondation Thierry Latran (OHEX Project), l&#39;association française de myopathie ( numéro de subvention 16026) et Target ALS sont appréciés. Felix Leroy était le destinataire d&#39;un &quot;Contrat doctoral&quot; de l&#39;Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Les expériences ont été réalisées conformément aux directives européennes (86/609 / CEE et 2010-63-UE) et de la législation française, et ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université Paris Descartes. 1. Préparation de la moelle épinière Slice <ol><li> Préparer les solutions quotidiennes ou suivantes un jour à l&#39;avance. Si elles sont conservées pendant une nuit, bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 et de garder au réfrigérateur dans des flacons fermés hermétiquement. <ol><li> Préparer faible Na + liquide artificiel céphalorachidien (ACSF): 3 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, 230 mM de saccharose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl2, 8 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, l&#39; acide ascorbique 0,4 mM, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). Depuis Na-kynurénate est souvent difficile à dissoudre, assurez-vous d&#39;acheter celui indiqué dans le tableau des matériaux. </li><li> Préparer solu K-gluconatetion: 130 mM de K-gluconate, 15 mM de KCl, 0,05 mM d&#39; EGTA, 20 mM de HEPES, 25 mM de glucose, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de Na-pyruvate, ajusté à pH 7,4 avec du KOH. </li><li> Préparer ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO3, 25 mM de glucose, 0,4 mM d&#39; acide ascorbique, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). </li><li> Avant le début de la dissection, dissoudre 2% d&#39;agar dans 80 ml de la solution K-gluconate, et garder au chaud à 60 ° C. </li></ol></li><li> intracardiaque perfusion <ol><li> Effectuer cette préparation sur des souris femelles et mâles, âgés de P2 à P11. </li><li> Anesthésier la souris avec une injection intraperitoneale de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sodique (50 mg / kg). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;aiguilles ou de bande, immobiliser la souris sur le dos sur une grande boîte de Pétri remplie de silicium. Utilisez un Microscope disséquante pour le reste de la dissection. </li><li> Tenir la pointe du sternum, soulever la poitrine et couper la membrane à l&#39;aide de ciseaux fins. Ouvrez ensuite la poitrine des deux côtés en coupant à travers les côtes pour exposer le cœur. </li><li> Couper l&#39;oreillette droite avant de percer le ventricule gauche avec une aiguille de 27G. </li><li> Perfuser avec de la glace froide faible ACSF Na +. Au bout de 30 secondes, le plus bas de Na + ACSF doit être considéré circulant hors de l&#39;atrium. De faibles quantités de sodium empêchent les cellules à partir de dopage et à réduire la mort cellulaire lors de la dissection. </li><li> Maintenez l&#39;aiguille dans le cœur sous le microscope de dissection jusqu&#39;à ce que le foie devient jaune lorsque le sang est drainé. </li></ol></li><li> Spinal dissection du cordon <ol><li> Décapitez l&#39;animal et le mettre sur le ventre. </li><li> Retirez rapidement la peau du dos (figure 1A1). Faites deux coupes à travers les épaules et en descendant la cage thoracique (figure 1A2). Ensuite, couper le cordon en loe que possible dans la partie caudale afin d&#39;isoler la colonne vertébrale avec le début des nervures de la partie inférieure de l&#39;animal. Retournez l&#39;animal à nouveau et retirer les viscères encore attachés aux côtes. </li><li> Transférer la colonne vertébrale à un autre, plus petite boîte de Pétri silicium-rempli et utiliser 4 broches d&#39; insectes pour le maintenir dorsale vers le haut (figure 1A). </li><li> Perfuser en continu l&#39;animal avec l&#39; ACSF carbogène-barboter (à environ 4 ° C) tout en effectuant une laminectomie de la face dorsale, et l&#39; exposition de la moelle épinière de l&#39;extrémité rostrale (figure 1B). Pour ce faire, insérez la pointe des ciseaux fins entre l&#39;os et la moelle épinière et couper l&#39;os peu à peu de la fin rostrale, en veillant à rester à l&#39;écart de la matière blanche. Alternate de chaque côté tout en utilisant des pinces pour tenir à l&#39; écart de la bande de l&#39; os déjà coupé (Figure 1B1). </li><li> En utilisant les plus petits ciseaux et des pinces à ressort disponibles, soulevez la dure et coupesur les deux côtés tout en maintenant la partie non serrée de la dure-mère, afin d&#39;éviter d&#39;endommager la moelle épinière avec des ciseaux. Couper le long de l&#39;axe rostro-caudale. NOTE: La dure est une membrane continue semi transparent; à cet âge la pie - mère est trop fragile et se désagréger lors de la dissection et le tranchage (Figure 1B2). </li><li> Une fois que la dure est l&#39;utilisation enlevé un verre contondant ou embout en plastique pour pousser doucement le cordon sur le côté gauche de la gorge formée par la colonne vertébrale demi-coupe, et couper les racines ventrales et dorsales sur le côté droit, en partant du côté rostral , le plus éloigné où ils entrent dans le cordon (quelques mm au moins, Figure 1B2). </li><li> Répéter l&#39;opération sur le côté gauche, allant toujours de rostrale à caudale. Si gaucher, démarrer à partir du côté gauche, puis déplacer vers le côté droit. </li></ol></li><li> Incorporation dans la gélose <ol><li> Glissez le cordon de la colonne vertébrale. Utilisez une épingle d&#39;insectes plus petits à cernerle cordon avec la dorsale de surface et enlever délicatement toute pièce de membrane encore attaché à elle (Figure 1C1). </li><li> Une fois nettoyé, coupez les deux extrémités (figure 1C2). Insérez une épingle d&#39; insectes cintré dans la partie antérieure du cordon pour manipuler le cordon et notez son orientation (flèche dans la figure 1C2). Puis transférer la moelle épinière à une solution K-gluconate glacée. NOTE: Cette solution imite la composition intracellulaire du CSF et empêcher les cellules de mourir de choc osmotique une fois que les motoneurones seront coupés 26. </li><li> Une fois que la moelle épinière est dans la solution intra-cellulaire, prenez le bécher avec l&#39;agar du bain sec et refroidir sur un mélange de glace et d&#39;eau. </li><li> Gardez en remuant tout en mesurant la température. Lorsque la température atteint 38 ° C plonger la moelle épinière, en le tenant par la broche d&#39;insectes et le placer côté rostral vers le bas. Assurez-vous que la moelle épinière est comme straight que possible, loin des murs, partie caudale légèrement vers le haut (Figure 1D1). </li><li> Laisser le bécher dans le mélange de glace et de l&#39;eau pour permettre à l&#39;agar se solidifier le plus rapidement possible. Assurez - vous qu&#39;il reste en place et que le cordon est aussi droite que possible (Figure 1D1). </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Après solidification, découper le bloc d&#39; agar contenant de la moelle épinière , d&#39;une manière telle que la base du bloc est à un angle de 35 ° avec la partie lombaire du cordon (flèche sur la figure 1D2). La surface dorsale doit être orientée de la base (Figure 1D2). NOTE: Ceci est une étape critique dans la procédure, pour le maintien de la continuité des pools de motoneurones aux racines ventrales à partir de laquelle ils sortent. </li><li> Coller le bloc dans la chambre du vibratome en utilisant de la colle cyanoacrylate. Immergez en solution K-gluconate et ajouter la solution K-gluconate congelée en bouillie pour maintenirle bain refroidi (en dessous de 2 ° C). </li><li> Couper 350 - 400 um d&#39;épaisseur des tranches de la région lombaire (identifiable par sa courbure et plus grand diamètre). Dans sa bonne orientation (voir 1.4.1.), Utilisez la lame pour couper de la dorsale à la surface ventrale et faire des tranches en continu plus rostrale. En règle générale, il y a 4-5 tranches convenables avec des racines ventrales étendant de 2 mm ou plus. Utiliser les paramètres suivants: angle de 10 °, 70 Hz, la fréquence de vibration et de 10 mm / min Vitesse de découpe. </li></ol></li><li> Incubation <ol><li> Transférer les tranches à ACSF à 34 ° C. Au bout d&#39;environ 30 minutes, refroidir les tranches jusqu&#39;à la température ambiante et commencer la session d&#39;enregistrement. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection A1:. L&#39; élimination de la peau du dos pour exposer la colonne dorsale A2:Coupe des épaules et des côtes pour libérer la dorsale colonne B1:. Colonne vertébrale épinglé sur la boîte de Pétri silicium-rempli (côté dorsal haut, côté caudal gauche) B2:. Même avec la moelle épinière exposée et disséqués C1:. Moelle épinière isolée . (côté gauche rostrale) C2: moelle épinière prêt à être embarqué (face ventrale, latérale rostrale gauche). Notez la broche d&#39;insecte plus petit sur le côté rostrale D1:.. La moelle épinière dans le bécher de gélose (côté rostrale dow, face ventrale tournée vers le bas) D2: Couper le bloc de gélose avec la moelle épinière incorporée. Notez l&#39;angle de 35 ° les formes de la moelle épinière à la base du bloc et le renflement lombaire (flèche). Barres d&#39;échelle 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. Placer le Slice dans la Chambre NOTE: Ventral racines sont de taille variable. <ol><li> Préparer une boîte de diverses pipettes avec des diamètres de pointe allant de 40 à 170 pm à l&#39;avance. Pour préparer les pipettes d&#39;aspiration, préparer de nombreux pipettes avec un long cône. L&#39;utilisation d&#39;un couteau de diamant, faire une coupe à différentes positions. Puis, sous un microscope à dissection, briser en frappant la pointe avec des pincettes. </li><li> Retirer la chambre du microscope d&#39;enregistrement et de le placer sous un microscope à dissection. </li><li> Sélectionner une tranche contenant une racine ventrale d&#39;une longueur suffisante de 2 mm (ou plus) pour être monté sur une électrode de stimulation d&#39;aspiration. Sélectionnez la bonne orientation de la tranche avec les racines ventrales vers le haut (figure 2A) et couper délicatement l&#39;agar autour des racines ventrales tout en laissant le reste de l&#39;agar autour de la tranche (figure 2B). NOTE: Parce que l&#39;agar-agar est plus ferme que la tranche, cela va permettre aux fils de l&#39;ancre de la tranche de se reposer sur l&#39;agar plutôt que sur la tranche et donc unnchor ne sera pas endommager le tissu. Assurez - vous que les fils de l&#39;ancre de la tranche sont au- dessus de la piscine du motoneurone (en rouge sur la figure 2C). </li><li> Monter la chambre arrière sur le microscope et perfuser en continu la chambre d&#39;enregistrement avec ACSF à un taux de 1 - 2 ml / min, à la température ambiante. En utilisant une pipette en verre rempli d&#39;ACSF et relié à une seringue, une aspiration de la racine ventrale (flèche sur la figure 2C). Afin d&#39;obtenir une bonne stimulation de la racine ventrale, la pointe de la pipette doit être serré autour de la racine ventrale. Un pôle doit être de l&#39;électrode de stimulation et l&#39;autre dans le bain (ou relié à la plaque d&#39;électrode de référence de serrage). </li><li> Réaliser l&#39; enregistrement patch-clamp du type cellulaire souhaité et enregistrer l&#39;effet de la stimulation de la racine ventrale comme décrit previsouly 10. <ol><li> Ici, utiliser un amplificateur pour l&#39;acquisition de données. Filtrez les enregistrements de cellules entières à 3 kHz. Numérisez à 10 kHz. Compenser résistance pont currele mode NT-pince. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figure 2. ventral Racine Préparation R: Lumbar tranche de la moelle épinière noyée dans de la gélose à la racine ventrale vers le haut B. Lumbar tranche de la moelle épinière avec les racines ventrales libérés de l&#39;agar - agar . C: Lumbar tranche de la moelle épinière avec une électrode de stimulation ajusté serré autour des racines ventrales (flèche) . Notez l&#39;emplacement des cellules de Renshaw exprimant la fluorescence rouge dans le 28 chrna2-Cre souris croisé avec le journaliste de la souris R26 Tom 17. Les barres d&#39;échelle 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

tranchage Oblique de la moelle épinière est importante car elle permet une stimulation unilatérale des pools de motoneurones et les cellules de Renshaw à un segment vertébral unique d&#39;une manière fiable, complète et spécifique. En outre, il permet une identification rapide, élégant et non-ambiguë des motoneurones enregistrées. Ensuite, nous allons mettre en évidence les avantages de cette technique par rapport à d&#39;autres méthodes de préparation de tranche, puis nous allons insister sur les piège...

Historiquement, les enregistrements de motoneurones utilisant sharp-électrode ont été réalisées in vivo sur les grands animaux tels que les chats ou rats 1 ou sur un ensemble de la moelle épinière isolée chez la souris 2. L&#39;émergence de la technique d&#39;enregistrement patch-clamp pendant les années 1980, a appelé à un accès direct à la motoneurone somas que l&#39;étanchéité nécessaire pour être réalisé sous guidage visuel. Ainsi, la moelle épinière préparation de tranche a été facilement atteint depuis le début des années 1990 3. Cependant, au début de la préparation tranche souvent ne permettait pas la stimulation des racines ventrales. Au meilleur de notre connaissance, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales, et aucun n&#39;a été obtenu à partir de souris 4,5. Dans cet article, nous présentons une technique pour obtenir des tranches viables de la moelle épinière de souris néonatale (P2 - P11) dans lequel le pool de motoneurones conserve ses racines au départ ventrales axones. conduitla stimulation de la racine ral déclenche potentiel d&#39;action antidromique de nouveau dans les somas de la piscine du motoneurone sortant de la même racine ventrale. Il excite aussi les cibles collatérales du motoneurone, d&#39; autres motoneurones 6-10 et les cellules de Renshaw 11-13. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones vers le bas les racines ventrales, nous utilisons l&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action antidromiques comme un moyen simple et définitive à physiologicaly identifier motoneurones 10. En plus d&#39;utiliser des critères électrophysiologiques et morphologiques potentiellement non inclusives ou trompeuses pour confirmer l&#39;identité des motoneurones, des études récentes sur les motoneurones de la moelle épinière invoquaient également fastidieuse et chronophage post hoc Colorations 16. Une telle identification est habituellement effectuée uniquement sur un échantillon des cellules enregistrées. D&#39;autres stratégies d&#39;identification reposent sur des lignées de souris dans lequel les motoneurones expriment une fluorescence endogène <sup&gt; 17-19. Cependant, en utilisant des marqueurs codés génétiquement peut être difficile à un jeune âge où l&#39;expression du marqueur est encore variable ou si l&#39;étude exige déjà en utilisant une lignée de souris transgéniques. En variante, l&#39;action antidromique enregistrements éventuels peuvent être effectués en routine sur toutes les souris à partir du début de l&#39;enregistrement de la cellule. Expérimentateurs travaillant sur intactes les préparations de la moelle épinière chez le chat, le rat et la souris, ont utilisé de manière fiable ces techniques d&#39;identification depuis les années 1950, 1,2,20,21. Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d&#39;action antidromiques de la quasi-totalité des motoneurones enregistrées. En outre, la stimulation de la racine ventrale peut être utilisé de manière fiable pour exciter les autres motoneurones 22,23 ou leurs cibles. les cellules de Renshaw 10,24,25. Nous présentons ici les applications de la stimulation de la racine ventrale sous la forme d&#39;actions antidromique enregistrements potentiels de motoneurone somas, ainsi que l&#39;excitation des cellules de Renshaw.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Na-kynurenate</td>
			<td >ABCAM</td>
			<td >ab120256</td>
			<td >dissolves better then other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHCO3&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2&#160;</td>
			<td >G Biosciences</td>
			<td >R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2&#160;</td>
			<td >Quality Biological</td>
			<td >351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glucose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ascorbic acid&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-pyruvate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-gluconate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX-314</td>
			<td >Alomone</td>
			<td>Q150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CsOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gluconic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vannas Spring Scissors - 2.5mm&#160;</td>
			<td >FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td colspan="2">Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibratome</td>
			<td >Campden</td>
			<td >Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches de la moelle épinière se sont révélés être une technique précieuse pour enquêter sur un large éventail de questions, de cellulaire aux propriétés du réseau. Nous montrons comment préparer des tranches obliques viables de la moelle épinière des souris jeunes (P2 - P11). Dans cette préparation, les motoneurones conservent leurs axones sortant des racines ventrales de la moelle épinière. La stimulation de ces axones suscite back-propageant des potentiels d&#39;action qui envahissent le soma des motoneurones et passionnants nantissements l&#39;motoneuronales au sein de la moelle épinière. Enregistrement des potentiels d&#39;action antidromiques est une façon immédiate, définitive et élégante pour caractériser l&#39;identité du motoneurone, qui surpasse les autres méthodes d&#39;identification. En outre, la stimulation des nantissements de motoneurones est un moyen simple et fiable pour exciter les cibles collatérales des motoneurones au sein de la moelle épinière, comme d&#39;autres motoneurones ou Renshaw cellules. Dans ce protocole, nous présentons les enregistrements antidromiques du motoneurone somas ainsi que Renshaw cellulaire excitation, résultant de la stimulation de la racine ventrale.

Confirmation de motoneurones Identité utilisant Potentiels antidromique action ciblage cellulaire Motoneurones se trouvent dans la corne ventrale (visible en rouge sur la figure 2C). Commencez par le faisceau d&#39;axones formant la racine ventrale et remonter jusqu&#39;à ce que le faisceau se disperse complètement...

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The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K vues.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales. 

Vidéo: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Recherche

Neurosciences

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Préparation Mont entiers de l&#39;Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Préparation des tranches de parasagittales d&#39;enquête sur les dorso-ventrale de l&#39;Organisation des rongeurs cortex entorhinal médian

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Une procédure pour l&#39;implantation d&#39;une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du cordon spinal de souris

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

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La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d'aspiration

Préparation Mont entiers de l'Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

Préparation des tranches de parasagittales d'enquête sur les dorso-ventrale de l'Organisation des rongeurs cortex entorhinal médian

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Une procédure pour l'implantation d'une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

poisson zèbre

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa