Les expériences de tranche de cerveau permettent l’interrogation de la fonction neuronale avec la résolution électrique et temporelle élevée, mais ces tranches coupent typiquement beaucoup de connexions presynaptic. Une tranche en forme de coin maintient un circuit présynaptique plus intact. Cette tranche de cerveau modifiée maintient un circuit neuronal in vivo-like plus complet tout en fournissant les avantages de l’expérimentation in vitro, telle que les enregistrements visuellement guidés de pince de correction, la pharmacologie, et l’imagerie d’activité.
La géométrie précise des tranches compensées peut être estimée en fonction de l’emplacement de l’atlas des neurones dans le circuit, mais l’intégrité des schemata et des axones présynaptiques doit être déterminée à l’aide de l’histologie. Commencez par utiliser une lame de rasoir pour couper la peau à la ligne médiane du crâne du nez à l’arrière du cou. Peler la peau pour exposer le crâne et à partir de la base du crâne et en continuant vers le nez, utiliser de petits ciseaux pour faire une incision dans le crâne à travers la ligne médiane.
À la suture lambda, faire des coupures dans le crâne de la ligne médiane latéralement vers l’oreille des deux côtés pour peler le crâne pour exposer le cerveau. À partir de l’extrémité rostrale, utilisez une petite spatule de laboratoire pour soulever doucement le cerveau du crâne pour permettre aux nerfs optiques d’être sectionnés. Continuez à travailler doucement le cerveau vers l’arrière, exposant la surface ventrale et utilisez des forceps fins pour pincer soigneusement les nerfs trigeminaux près de la surface ventrale du tronc cérébral pour les couper.
Placer la préparation dans une boîte de Pétri en verre remplie d’une solution de tranchage froid et placer le plat sous un microscope à disséquer. Coupez les nerfs faciaux près du tronc cérébral pour exposer les nerfs vestibulocochlear. Utilisez des forceps fins pour pousser les pointes dans le foramina où le nerf vestibulocochlear sort du crâne autant que possible.
Pincer pour couper les nerfs des deux côtés, en laissant la racine nerveuse attachée au tronc cérébral. Retirez les méninges et la vascularisation de la surface ventrale du tronc cérébral près du corps trapézoïde. Pincez ensuite les nerfs crâniens restants et le tissu conjonctif pour libérer complètement le cerveau du crâne, en prenant soin de préserver le reste de la moelle épinière, si possible.
Pour préparer la surface du cerveau pour l’appareil à la scène placer le côté ventral du cerveau vers le haut et utiliser un outil contondant pour immobiliser doucement la moelle épinière pour stabiliser le tissu cérébral. Insérez des forceps ouverts à un angle d’environ 20 degrés à travers le cerveau jusqu’au fond du plat afin que les extrémités sortent de la surface dorsale du caudal cérébral jusqu’au chiasm optique et utilisent une lame de rasoir pour couper le long des forceps. Ensuite, préparez un bloc d’un centimètre cube de 4% d’agar et étalez une petite goutte de colle dans un rectangle sur la scène.
Utilisez des forceps pour soulever soigneusement le cerveau et tamponner doucement l’excès de liquide avec le bord d’une serviette en papier. Placez ensuite la surface bloquée sur la colle de sorte que la surface ventrale sera orientée vers la direction de la lame pendant le tranchage et poussez doucement le bloc d’agar contre la surface dorsale comme support. Pour acquérir des tranches compensées avec la racine nerveuse cochléaire sur le côté épais et les neurones olivocochléaires médiaux et le noyau médial du corps trapézoïde sur le côté mince, placez le disque magnétique avec le cerveau attaché sur le support de scène et placez le support dans la chambre de tranchage d’un vibratome avec la surface ventrale du cerveau orientée vers la lame.
Remplissez la chambre d’une solution de tranchage glacé et abaissez la lame dans la solution à bulles carbogen. Couper les tranches caudales à la région d’intérêt pour s’assurer que les tranches sont symétriques. Déplacez ensuite la scène d’environ 15 degrés d’un côté.
Continuer à trancher soigneusement jusqu’à ce que la racine nerveuse auditive soit près de la surface d’un côté et que le nerf facial puisse être vu à la surface de l’autre côté de la tranche. Déplacez la scène de 15 degrés vers la position d’origine et éloignez la lame du tissu. Faites tourner la base de la scène à 90 degrés de sorte que le bord latéral du côté mince soit face à la lame et abaissez la lame de plusieurs centaines de microns avant d’amener lentement la lame près du bord du tissu.
Avec la lame rétractée légèrement abaisser la lame à l’épaisseur désirée du bord mince de la tranche. Déplacez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène vers l’arrière de sorte que la surface ventrale fait face à la base de la scène. Faire une coupe pour désigner la surface rostrale de la tranche compensée et transférer la tranche à un morceau carré centimètre de papier d’interface caudle surface vers le bas.
Le nerf facial doit être visible sur les deux hémisphères de la tranche sur la surface rostrale. Déplacez ensuite la tranche dans une chambre d’incubation de 35 degrés Celsius pour la récupérer pendant 30 minutes. Pour mettre en place la tranche compensée pour l’analyse électrophysiologique placer l’échantillon dans une chambre d’enregistrement qui est continuellement perfusé avec 35 degrés Celsius ACSF et stabiliser la tranche.
À l’aide de l’optique DIC, concentrez-vous sur la racine nerveuse auditive sur le côté épais de la tranche et utilisez un micromanipulateur pour déplacer l’électrode bipolaire stimulant le tungstène vers la racine nerveuse auditive et doucement dans la surface du tissu. Déplacez le champ de vision vers le noyau ventral du corps trapézoïde sur le côté mince et sélectionnez un neurone olivocochléaire médial comme cible pour l’électrophysiologie de pince de correction sous épifluorescence utilisant un filtre d’émission de nanomètre de 561. Remplissez une pipette d’enregistrement avec la solution interne appropriée pour l’expérience proposée et sous patch optique DIC et enregistrez à partir du neurone olivocochléaire médial dans la configuration de l’ensemble des cellules.
Ajustez l’amplitude de stimulation électrique de la racine auditive de nerf pour obtenir des événements postsynaptiques cohérents dans le neurone olivocochléaire médial. Ensuite, exécutez des protocoles de stimulation appropriés pour observer les courants synaptiques évoqués dans les neurones olivocochléaires médiaux. Cette préparation de tranche compensée est conçue pour contenir la racine nerveuse auditive et le noyau cochléaire contralatéral aux neurones olivocochléaires médiaux ciblés pour les enregistrements.
Dans cette tranche de coin resectionnée tachée de violette crésyle, le noyau cochléaire est présent dans presque toute son étendue rostrale-caudale. Et la racine nerveuse auditive est observée entrant dans le noyau cochléaire. En outre, la tranche compensée contient des neurones du noyau médial du corps trapézoïde ipsilateral aux neurones olivocochléaires médiaux à partir de laquelle les enregistrements sont effectués.
Pour confirmer la connectivité neuronale dans une tranche compensée, les entrées présynaptiques sont stimulées de deux façons. Tout d’abord, la strie acoustique ventrale à la ligne médiane est stimulée électriquement, activant directement les axones t-stellate et le noyau médial des neurones du corps trapézoïde par stimulation globulaire de l’axone des cellules touffue et entraînant des courants postsynaptiques qui sont mesurés au neurone olivocochléaire médial. La racine auditive de nerf est alors stimulée pour activer les circuits ascendants entiers de tronc cérébral monaural et pour évoquer des réponses postsynaptiques.
La comparaison des mesures de latence de début du premier courant postsynaptique évoqué avec la stimulation directe de la stria acoustique ventrale avec ceux évoqués avec la stimulation auditive de nerf indique une latence sensiblement plus longue dans l’événement auditif de stimulation de nerf, indicatif du retard synapse synapse cochléaire additionnel de noyau activé pendant la stimulation auditive de nerf. L’utilisation de repères anatomiques et la manœuvre minutieuse de l’étape du disque magnétique sont essentielles pour créer des tranches compensées avec des circuits neuronaux intacts et des réponses post synaptiques fiables évoquées. Cette technique de tranchage fournit une plate-forme pour l’utilisation d’outils supplémentaires d’électrophysiologie in vitro, y compris l’imagerie par calcium ou tension, optogénétique, neurotransmetteur décaging, et à la fois intracellulaire et extracellulaire pharmacologie.
