Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans les domaines de la découverte d’insecticides et de la lutte antivectorielle. Par exemple, dans quelle mesure une chimie non formulée est-elle toxique pour une population de larves de moustiques ou d’adultes? La chimie a-t-elle un potentiel de développement comme larvicide ou adulticide?
Et, quelle pourrait être la voie de livraison la plus efficace? Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut être utilisée pour évaluer la toxicité des chimies non formulées La toxicité d’une chimie contre plusieurs espèces de moustiques vecteurs, et elle peut être augmentée jusqu’à evalute des centaines de composés en capacité de débit élevé. Jasleen Kaur, technicien scientifique de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer, étiquetez les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Utilisez un équilibre analytique pour peser le composé d’essai. Ensuite, dissoudre le composé dans de l’eau distillée double stérile dans un tube de 1,5 mL, résultant en une solution de stock de 80mM.
Ensuite, diluer en série la solution de stock en utilisant de l’eau distillée double pour préparer des solutions de stock de travail des concentrations souhaitées. Notez qu’il faut prendre soin des larves qui sont ajoutées aux puits, lors de l’élimination de l’excès d’eau et lorsque la chimie d’essai est ajoutée pour éviter les dommages physiques aux larves. Les blessures peuvent augmenter la mortalité, et ainsi produire de faux résultats positifs ou invalider l’analyse.
Utilisez une pipette de transfert en plastique à alésage large pour transférer cinq larves de troisième stade à chaque puits de la plaque. Ensuite, utilisez une pipette d’un mL pour enlever délicatement l’eau et la remplacer par le volume désiré d’eau distillée double. Veillez à ne pas toucher les larves lorsque vous retirez l’eau travailler rapidement pour s’assurer que les larves ne se dessèquent pas, et ajouter doucement la chimie d’essai en pipetting contre le côté opposé du puits en plastique.
Ajoutez un volume approprié de solution d’essai à chaque puits et faites pivoter doucement la plaque pour assurer un mélange uniforme. Placez la plaque dans une chambre de croissance en maintenant le cycle lumière/obscurité de 12 heures à 25 degrés Celsius avec 75 à 85 pour cent d’humidité relative. Pour vérifier le mouvement larvaire, appuyez doucement sur la plaque.
Si aucun mouvement n’est observé, touchez doucement la larve avec un cure-dent stérile. Marquer la larve comme morte si aucune réponse n’est remarquée, et utiliser une feuille de pointage pour enregistrer le nombre total de larves mortes dans chaque puits, aux points de temps décrits dans le protocole de texte. Culture de trois à cinq jours moustiques femelles adultes dans une cage en plastique de 20 litres.
Étiquetez neuf tasses en papier d’once avec le nom et la concentration du composé d’essai. Ensuite, préparez une solution de stock de 10mg/mL du composé d’essai dans l’acétone dans un flacon en verre de 20mL. Ensuite, diluer en série la solution stock pour obtenir les concentrations de travail souhaitées.
Nettoyez la seringue en verre d’un mL avec de l’acétone. Remplissez-le ensuite de la solution de test à la concentration appropriée. Sécurisez la seringue dans un micro-applicateur ajusté pour fournir un volume de 0,25 uL.
Ensuite, utilisez un aspirateur pour enlever les moustiques femelles adultes de 10 à 5 jours de la cage. Anesthésiez-les pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer ensuite les moustiques dans une boîte de Pétri.
Déposer le plat sur la glace pendant 10 minutes. Afin d’éviter d’endommager le moustique adulte, ce qui pourrait contribuer à la mortalité, assurez-vous qu’ils ne sont pas anesthésiés au réfrigérateur pendant plus de cinq minutes, ou immobilisés sur la glace pendant plus de 10, et de minimiser la manipulation des moustiques. Si vous avez accès à une plaque froide et à un micromanipulateur avec un stade mobile, cela peut réduire davantage la manipulation des moustiques.
Utilisez de fines pinces à épiler pour retirer chaque moustique du plat. Avec le micro-applicateur de seringue appliquer 0,25uL de solution d’essai au thorax dorsal, sous un microscope dissection Suivant, transférer les moustiques à une tasse de papier étiqueté sur la glace. Sceller la tasse avec un carré de maille de 10 par 10cm et un élastique Puis, le transférer à la chambre de croissance, et enregistrer le nombre de moustiques morts comme décrit précédemment.
Recueillir environ 150 moustiques femelles adultes de quatre à cinq jours avec un aspirateur, et les transférer dans une cage séparée. Retirer la source de sucre une à 24 heures avant l’analyse d’alimentation. Préparer une solution de stock de 80mM du composé d’essai dans l’eau.
Ensuite, diluer en série avec de l’eau, pour obtenir des solutions de stock de travail des concentrations désirées. Pour obtenir les concentrations d’essai désirées, ajouter 40uL de chaque dilution à 960uL de sang de lapin défibrinated dans un tube de 1.5mL, et mélanger par pipetting. Placez un filtre membre sur une unité d’alimentation et scellez-le à l’aide d’un anneau en caoutchouc.
Ensuite, utilisez une pipette pour transférer un mL de sang avec la solution d’essai par le port de livraison, situé sur le côté inverse de l’unité d’alimentation. Attachez l’unité d’alimentation à une unité de chauffage. Ensuite, tamponnez doucement la surface de la membrane avec une solution d’acide lactique fraîchement préparée à 10 %.
Placez l’unité d’alimentation dans la cage. Couvrez la cage d’un chiffon foncé et laissez les moustiques se nourrir pendant une heure. Après l’alimentation des moustiques, placer la cage dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour anesthésier les moustiques.
Ensuite, comptez et enregistrez le nombre total de moustiques dans la cage. En examinant l’abdomen, comptez et enregistrez le nombre total de moustiques femelles entièrement et partiellement nourris. Un minimum de 50 moustiques nourris au sang doit être obtenu par dose.
Enlevez les moustiques qui ne se sont pas nourris. Ensuite, transférez la cage dans une chambre de croissance et utilisez une feuille de pointage pour enregistrer le nombre de moustiques morts aux points de temps appropriés. Le troisième jour de l’alimentation post-sang, placer une tasse d’oeufs dans la cage pendant 72 heures.
Utilisez un microscope disséquant pour compter le nombre total d’œufs produits par traitement. Un essai de contact larvaire a été exécuté pour évaluer l’effet de l’amitriptyline, un antagoniste de récepteur de dopamine, sur la mortalité larvaire au fil du temps. Les données ont révélé que la valeur du LC 50 diminue au fil du temps au cours de l’expérience.
L’effet de l’amitriptyline sur la mortalité des moustiques femelles adultes a été comparé à la bifenthrine, et deux contrôles négatifs. Par rapport aux contrôles négatifs traités et non traités d’acétone, l’amitriptyline et la bifenthrine ont induit la mortalité significative à chaque point expérimental de temps. Un test d’alimentation quantitatif a été effectué pour évaluer l’effet de trois doses différentes d’amitriptyline sur la fécondité et la mortalité en pourcentage des moustiques femelles adultes.
Les données n’ont révélé aucune différence statistiquement significative dans la fécondité des moustiques nourris à l’amitriptyline à la dose la plus élevée par rapport aux seuls témoins nourris au sang. Une fois maîtrisé, l’un des analyses que nous avons décrits ici, peut être complété en environ deux heures par une seule personne, si elle est correctement effectuée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler doucement l’organisme, et il devrait y avoir cohérence pendant des applications topiques et pendant l’essai larvaire ou adulte de notation.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme les essais biologiques pour évaluer la toxicité par absorption, par l’intermédiaire du moustique tarsi, de l’analyse de la bouteille cdc et de l’analyse des tubes de l’OMS peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions concernant l’efficacité de la chimie non formulée, ou un produit formulé, et le potentiel de développement comme insecticide de contact ou pulvérisateur spatial.
