We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOTE: Les trois parties du protocole décrivent l&#39;exposition aqueuse du médicament DZNep à larves de moustiques, une exposition sur la base de sang de DZNep aux femelles adultes pour étudier son effet de la fécondité, et SAH hydrolase inhibition par DZNep mesurés en utilisant une technique colorimétrique simple. Une représentation schématique de ces essais est représenté sur la Figure 1. 1. immatures développement Mosquito et la survie dosages NOTE: Cette section explique l&#39;utilisation d&#39;un médicament soluble dans l&#39;eau qui affecte le développement des larves de moustiques et de survie. <ol><li> Hatch A. oeufs gambiae à 28 ° C dans l&#39;eau distillée (dH 2 O) et les larves arrière stade leur 2 ème. </li><li> Prenez une DNAse six puits, RNAse plaque de culture cellulaire et versez 10 ml dH 2 O dans chaque puits. </li><li> Sélectionnez larves de moustiques au 2 ème stade et ajouter 15 larves par puits. Avant d&#39;ajouter 2 ème stade larvaire à l&#39;assiette, put les sur une serviette de papier pour 2-3 sec pour enlever l&#39;excès d&#39;eau. </li><li> puits d&#39;étiquetage avec des bandes de couleur à randomisent expérience. Étiqueter deux puits par concentration d&#39;essai sur chaque plaque (Figure 2). </li><li> Préparer un chlorhydrate 1 mM DZNep (MW = 298,73) solution mère en dissolvant 0,3 mg DZNep dans 1 ml de dH 2 O. Ajouter solution stock de DZNep.HCl aux puits marqués pour atteindre une concentration finale de 0,5 uM et 5,0 uM. NOTE: La solution stock peut être conservé à 4 ° C pour le court terme (un jour à un mois) ou -20 ° C pour le long terme (plus d&#39;un mois). REMARQUE: Ajout de la solution de stock pour concentrations susmentionnées ne changera pas le volume d&#39;eau dans les puits de manière significative. Toutefois, en cas de concentrations beaucoup plus élevées, il est souhaitable de dissoudre le composé dans le milieu des larves pour éviter toute dilution inutile du composé. </li><li> Ajouter la même quantité de nourriture pour poissons en flocons à chaque puits. Recouvrir la plaques et les incuber à 28 ° C dans un incubateur. </li><li> Enregistrer le taux de mortalité pour les larves de moustiques DZNep-traités et non traités, après une période d&#39;exposition de 24 h. Retirez et jetez les larves morts. Répétez cet enregistrement tous les jours jusqu&#39;à ce que toutes les larves meurent ou se nymphoser et émerger comme adultes. Notez la taille des larves tous les deux jours, ce est à dire, le jour 0, 2, 4, 6, 8, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se transforment en pupes. </li><li> Analyser les données de développement et de mortalité des larves en utilisant un logiciel statistique adéquate d&#39;analyse. NOTE: Un graphique à barres peut être utilisé pour représenter les données de mortalité dans Microsoft Excel. Analyse multidimensionnelle de la variance (MANOVA) réalisée avec un logiciel tel que JMP ou SPSS va révéler si des doses différentes du médicament entraîner la survie significativement différent des larves de moustiques. </li></ol> 2. Fécondité Assay en administrant des drogues Grâce Feeder artificielle à moustiques femelles NOTE: Cette section décrit l&#39;ajout de la drogue à un sange en l&#39;amenant à moustiques femelles adultes en utilisant un système d&#39;alimentation artificielle. <ol><li> Mettre en place des cages de moustiques adultes avec le même nombre de moustiques mâles et femelles pour le contrôle et la cage de test. Fournir une solution sucrée à 10% trempé dans des boules de coton à la fois les cages jusqu&#39;à ce que les femmes sont prêtes pour l&#39;alimentation (3-5 jours est optimale pour Anopheles gambiae). </li><li> 2 heures avant le repas de sang, enlever les boules de coton pour assurer femelles ont faim. </li><li> Assembler deux dispositifs d&#39;alimentation sanguins artificiels qui se composent d&#39;un grand entonnoir inversé à fond de verre (diamètre = 50 mm, longueur = 70 mm) et une matière plastique entourant scellée avec de la colle industrielle. Fixez des tubes en plastique (diamètre = 7 mm) à deux sorties «mangeoires (diamètre = 10 mm) via des connecteurs pour entrées et sorties de l&#39;eau. Étiqueter les deux mangeoires que &quot;Control&quot; et &quot;5 uM DZNep.&quot; </li><li> En utilisant un élément de chauffage disponible dans le commerce, mis en place le programme pour l&#39;alimentation. Dans &quot;Menu&quot; Aller à &quot;Paramètres&quot;et sélectionnez &quot;Consignes&quot;; programmes préchargés apparaîtront. Sélectionnez &quot;SP1&quot; et régler la température de 37 ° C. NOTE: L&#39;élément chauffant se assure que le sang administré est maintenue à une température constante. Paramètres de programme supplémentaires peuvent être utilisés pour différentes espèces de moustiques ou d&#39;insectes. </li><li> Remplissez un seau avec de l&#39;eau et plongez l&#39;élément de chauffage dans l&#39;eau. </li><li> Coupez un morceau carré de Parafilm (50 mm x 50 mm) et l&#39;étirer de faire un film membraneuse mince. Couvrir le fond des mangeoires artificielles avec le Parafilm. Coupez un autre morceau de Parafilm (50 mm x 10 mm), l&#39;étirer et sceller les bords des mangeoires. </li><li> Assembler le système, la connexion des lignes d&#39;alimentation et l&#39;élément de chauffage par les tubes. Une fois terminé, basculer sur le système et sélectionnez &quot;SP1&quot;. Appuyez sur &quot;Entrée&quot; pour démarrer le système. REMARQUE: L&#39;eau va se échauffer à 37 ° C et maintenu à cette température. </li><li> Surveiller etempérature de l&#39;eau de e en utilisant un thermomètre dans le réservoir d&#39;eau. REMARQUE: Les connecteurs et tubes aident à maintenir une circulation constante de l&#39;eau à travers le système de sorte que la température du sang reste à 37 ° C. </li><li> Remplissez un bac à fond plat avec une solution d&#39;eau de Javel à 10% qui sera utilisé pour décontaminer tout déversement de sang. </li><li> Ajouter 2 ml de sang de mouton défibrillation à un tube à microcentrifugation. Nommez ce que &quot;Control&quot;. Répétez le processus pour le tube expérimentale étiquetés comme &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 pi de solution stock DZNep (voir l&#39;étape 1.5) au tube expérimentale intitulée «5 uM DZNep&quot; Mélanger délicatement le sang et médicaments en inversant plusieurs fois. Incuber le tube 10 min à température ambiante. </li><li> En utilisant une pipette, ajouter 2 ml de contrôle et de test sanguin vers le haut de mangeoires étiquetés en conséquence. Jeter la pipette dans la solution d&#39;eau de Javel. Couvrir la cage avec un sac sombre et respirer de l&#39;air sur la cage périodiquement pour encourager females pour l&#39;alimentation. </li><li> Laissez les moustiques se nourrissent pendant environ 30 min. Une fois que l&#39;alimentation est terminée, éteignez l&#39;élément de chauffage, prendre les mangeoires et les dépouiller le Parafilm. Faire tremper le chargeur dans une solution d&#39;eau de Javel pour environ 5 min et bien rincer à l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Enlevez les mangeoires et de mettre des boules de coton avec de l&#39;eau de sucre sur les cages pendant 48 heures. Placer un plat d&#39;œufs contenant de l&#39;eau et le papier filtre dans les cages de nuit pour faciliter la ponte. Étiqueter chaque plat d&#39;œufs avec la concentration d&#39;essai ou de contrôle respective. </li><li> Retirez le plat d&#39;œufs lendemain et examiner le nombre et la structure des œufs sous un microscope stéréo. Obtenir des images en utilisant le logiciel Q-colors5. Comptez le nombre d&#39;œufs. Analyser différence dans le nombre d&#39;œufs obtenus à partir de tests et de contrôle des cages. REMARQUE: Un test t non apparié peut être utilisé pour déterminer si le nombre d&#39;oeufs sont significativement différentes (p ≤0.05). </li></ol> 3. biochimique Dosage de Mosquito Inhibition enzymatiquepar médicaments NOTE: Cette section décrit un dosage de l&#39;activité de l&#39;enzyme en utilisant DTNB comme indicateur pour déterminer l&#39;effet de DZNep sur SAH hydrolase inhibition chez les mâles adultes et les moustiques femelles. <ol><li> Préparer un M de Na 2 HPO 4 (phosphate de sodium dibasique) solution à 0,1 par addition de 14,19 g de Na 2 HPO 4 à 1 L de dH 2 O. Ensuite, préparer un M NaH 2 PO 4 (phosphate de sodium monobasique) solution à 0,1 par addition de 13,79 g de NaH 2 PO 4 à 1 L de dH 2 O. </li><li> Titrer le M Na 2 HPO 4 solution à 0,1 avec le 4 solution à 0,1 M NaH 2 PO à pH 8,5. NOTE: Ce sera la solution de travail des stocks de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Préparer une solution d&#39;homogénéisation de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) par addition de 0,3% de Triton X-100. NOTE: La solution d&#39;homogénéisation peut être conservé à 4 o C. </li><li> Prepare une SAH 1,6 mM (PM = 384,4) solution en dissolvant 6,15 mg de SAH dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Préparer une mM DTNB 1,6 (PM = 396,4) solution en dissolvant 6,3 mg de DTNB dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Conserver la solution de DTNB frais sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer un mM DZNep.HCl 1 (MW = 298,73) solution en dissolvant 0,3 mg de DZNep dans 1 ml dH 2 O. Ensuite, diluer la solution 1 mM DZNep en une série de concentrations allant de 1,000 pM à 0,002 pM dans dH 2 O. </li><li> Pour mesurer la SAH hydrolase inhibition par DZNep, préparer un extrait d&#39;enzyme brute de moustiques: Homogénéiser 10 moustiques adultes non gorgés dans 1 ml de glace-froid 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenant 0,3% de Triton X- 100, en utilisant un homogénéiseur de tissu de verre. Transférer le broyat dans un tube de 1,5 ml à centrifuger. </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat pendant 5 min à 10 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un environnement propre1,5 ml de tube à centrifuger. Utiliser le surnageant comme source d&#39;enzyme pour le dosage biochimique SAH. </li><li> Pour le traitement à blanc (ce est à dire, pas DZNep, aucune enzyme), ajouter 50 ul de 1,6 mM de SAH, 50 ul de 1,6 mM de DTNB, et 100 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) dans les puits individuels d&#39;un 96 puits, microplaque à fond plat. </li><li> Pour le contrôle (ce est à dire, pas DZNep), ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 ul, 50 ul de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) et 50 ul enzyme (SAH hydrolase obtenue à partir d&#39;extrait brut) à la personne puits. </li><li> Pour les traitements DZNep, ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 pi, 50 pi et 50 pi enzyme concentration choisie DZNep à des puits individuels. Préparer 4 répétitions par traitement et de contrôle. </li><li> Lire la densité optique (DO) des échantillons d&#39;enzyme SAH à 405 nm pendant 5 min à 20 secondes d&#39;intervalle en utilisant un lecteur de microplaques de 96 puits. </li><li> Soustraire la DO du contrôle d&#39;une viergee traitement OD obtenue à partir de chaque puits. Calculer le pour cent restants activité hydrolase SAH utilisant l&#39;équation suivante:% d&#39;activité résiduelle = (Traitement OD / contrôle OD) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il ya plusieurs étapes essentielles à la bonne application de ce protocole. Pour le dosage des larves, il faut prendre soin d&#39;étiqueter correctement et de reproduire chaque concentration d&#39;essai. Randomisation échantillons d&#39;essai et en ajoutant le montant désigné de médicament à des puits d&#39;essai respectifs est une partie importante de ce dispositif expérimental mis en place. Avant d&#39;ajouter 2 ème stade larvaire des moustiques à une microplaque de 96 puits, chaque larve peut ê...

Le paludisme est responsable pour le plus grand nombre de décès liés à insectes dans le monde. Quelque 219 millions de cas se produisent chaque année dans le monde, entraînant environ 660 000 décès, principalement en Afrique 1. Malgré les efforts concertés, les programmes de lutte contre le paludisme sont confrontés à plusieurs défis. Bien que les moustiquaires imprégnées d&#39;insecticides à effet rémanent dans les composants et sous forme de pulvérisation de clés du programme, la résistance aux insecticides chez les populations locales entravent ces efforts 2. L&#39;augmentation rapide des populations de moustiques résistants aux insecticides est largement attribuable à la capacité des moustiques vecteurs du paludisme se adapter rapidement aux changements dans leur environnement et d&#39;exploiter différentes niches 3,4,5. Pour surmonter les mécanismes existants de la résistance aux insecticides, l&#39;exploration de nouvelles cibles d&#39;insecticide et des composés de la prochaine génération est justifiée. Un protocole simple, étape par étape pour déterminer l&#39;efficacité des insecticides expérimentaux sur les différentes étapes de la vie de paludisme mosquitoes pourrait considérablement améliorer ces efforts. Les études pharmacologiques des effets du médicament sur des lignées cellulaires et des modèles animaux ont établi l&#39;utilisation de médicaments épigénétiques comme un outil utile pour moduler la génétique et de la physiologie des cellules et des organismes. méthylation de l&#39;ADN et de modification des histones sont deux mécanismes épigénétiques qui affectent l&#39;expression génique dans des organismes multicellulaires, sans changer la séquence d&#39;ADN sous-jacente 6. Les modifications post traductionnelles telles que la méthylation jouent un rôle crucial dans le maintien de l&#39;intégrité cellulaire et l&#39;expression des gènes, et peuvent affecter plusieurs processus fondamentaux 7,8,9. Recherche dans certaines espèces d&#39;insectes ont souligné l&#39;importance de l&#39;épigénétique dans des procédés impliquant l&#39;ovogenèse et endiguer la maintenance de la cellule 10, ainsi que la compensation de dosage 11. Toutefois, ces aspects dans les vecteurs de maladies sont encore à explorer. L&#39;utilisation d&#39;un composé à moduler ce système chez les moustiques peut nous fournir ensites dans les nouvelles voies de cibles d&#39;insecticide. 3-déazaneplanocine A (DZNep) est un inhibiteur d&#39;histone méthylation connu, qui ont un impact sur ​​les différents types de cancers ont été étudiés 12,13,14,15,16. DZNep est un médicament soluble dans l&#39;eau stable qui inhibe indirectement épigénétique histone lysine N -méthyltransférase (EZH2), un composant du complexe répressif 2 Polycomb (PRC2) dans des cellules de mammifères. PRC2 joue un rôle important dans la régulation de la croissance des cellules souches dans les organismes multicellulaires, et la méthylation des histones est un aspect clé de la médiation PRC2 silençage génique. Chez les souris immunodéprimées, les cellules pré-traitées avec DZNep ont été montré pour être moins tumorigène 17. Ce médicament est de plus utilisée pour étudier d&#39;autres maladies, telles que la non-alcoolisées maladie du foie gras, dans lequel est impliqué EZH2 18. DZNep est un S -adenosylhomocysteine ​​établie (SAH) hydrolase inhibiteur de 19, 20. L&#39;inhibition de la SAH-hydrolase résultats dans unaccumulation de SAH et, à son tour, conduit à l&#39;inhibition de l&#39;activité méthyltransférase en limitant disponibles groupes donneurs de méthyle. SAH est un dérivé d&#39;acide aminé utilisé par de nombreux organismes, y compris les insectes, dans leurs voies métaboliques. Une étude récente a montré que DZNep à faibles doses peut affecter diapause et retarder le développement chez les insectes 21. Ici, un protocole robuste pour étudier les effets d&#39;un composé soluble dans l&#39;eau sur les différentes étapes de la vie de moustiques est développé. Les trois parties de ce protocole comprennent des instructions pour examiner les effets d&#39;un composé soluble dans l&#39;eau sur les moustiques femelles adultes immatures, de sang-alimentation et de l&#39;activité enzymatique de mâles adultes et les moustiques femelles. Premièrement, DZNep est dissous dans l&#39;eau pour étudier le développement de moustiques immatures et la survie. Ceci est réalisé à deux concentrations de comparer les différences résultant de dix fois plus de l&#39;exposition au médicament. Pour explorer l&#39;effet de la drogue sur les moustiques femelles adultes, DZNepest ajoutée au sang de mouton défibrillation et nourris artificiellement le sang aux femmes. Par la suite, les résultats de la drogue sur la fécondité est examinée. Enfin, un dosage de l&#39;activité enzymatique est réalisée en utilisant l&#39;acide 5,5&#39;-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB), comme indicateur pour déterminer l&#39;effet de la SAH-hydrolase sur DZNep inhibition chez le mâle adulte et les moustiques femelles. Bien que ce protocole est développé avec un moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae, il peut être facilement adapté à l&#39;étude des effets des composés d&#39;intérêt sur ​​les espèces de moustiques ou d&#39;autres insectes. Les techniques décrites dans le présent protocole ne peuvent être efficacement appliquées à un médicament avec une solubilité limitée ou pas dans l&#39;eau ou des milieux aqueux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

Résistance insecticide pose un problème majeur pour les programmes de lutte contre le paludisme. Les moustiques se adapter à un large éventail de changements dans l&#39;environnement rapidement, faire du paludisme contrôler un problème omniprésent dans les pays tropicaux. L&#39;émergence de populations résistantes aux insecticides justifie l&#39;exploration de nouvelles voies de cibles de médicaments et composés pour le contrôle des moustiques vecteurs. Médicaments épigénétiques sont bien établis dans la recherche sur le cancer, mais pas beaucoup est connu au sujet de leurs effets sur les insectes. Cette étude fournit un protocole simple d&#39;examiner les effets toxicologiques de 3-déazaneplanocine A (DZNep), un médicament épigénétique expérimental pour le traitement du cancer, sur le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae. Une augmentation dépendante de la concentration de la mortalité et de diminution de la taille a été observée chez les moustiques immatures exposés à DZNep, alors que le composé réduit la fécondité des moustiques adultes par rapport au témoin traitements. En outre, on observe une diminution de toxicomanes en S -adénosylhomocystéine (SAH) activité hydrolase chez les moustiques après une exposition à DZNep rapport à contrôler traitements. Ces protocoles prévoient le chercheur avec une procédure simple, étape par étape pour évaluer plusieurs paramètres toxicologiques pour un médicament expérimental et, à son tour, de démontrer une approche unique multi-broches pour explorer les effets toxicologiques des médicaments ou composés de épigénétiques solubles dans l&#39;eau intérêts contre les moustiques vecteurs et autres insectes.

La figure 1 est une représentation schématique des essais; il décrit les différentes étapes de la procédure indiquée dans cet article. Comme le protocole est basé sur les différents stades de vie des moustiques, il n&#39;y a pas séquence particulière à suivre pour les expériences détaillées ici. L&#39;utilisateur peut choisir d&#39;effectuer un ou plusieurs tests en même temps, en fonction de la disponibilité des échantillons. La Figure 2</st...

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Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K vues.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Vidéo: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injection d&#39;un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Recherche

Biologie

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocole pour des essais de l&#39;ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Prévenir la propagation du paludisme et la dengue utilisant moustiques génétiquement modifiés

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Bâtir un meilleur moustique: l&#39;identification des gènes de résistance Activation fièvre malaria et la dengue chez A. gambiae et A. aegypti

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualisation de la fonction respiratoire mitochondriale utilisant Cytochrome C Oxydase / succinate déshydrogénase (COX / SDH) Double-histochimie étiquetage

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocoles pour tester la toxicité des nouvelles chimies insecticides aux moustiques

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...