Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le champ centriole, comme la localisation des protéines dans une région spécifique du centriole. Le principal avantage de ces techniques que nous fournissons les moyens de concentrer centriole pour les obtenir dans de multiples orientations. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la biologie centriole chlamydomonas, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les centrioles humains isolés et paramecium.
Nikolai Klena, doctorant, Maeva Le Guennec, une autre doctorante, et le postdoc du laboratoire Davide Gambarotto feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez d’abord tous les médias et la culture des cellules C.Reinhardtii telles que décrites dans le protocole de texte. Transférer les cellules préparées dans des tubes coniques de 50 millilitres et les centrifuger à 600 fois g pendant 10 minutes.
Lavez la pastille une fois avec 50 millilitres de 1x PBS et faites tourner les cellules à nouveau à 600 fois g pendant 10 minutes. Utilisez une pipette pour resuspendre la pastille en 100 millilitres de tampon de déflagellation à température ambiante. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et ajoutez lentement 0,5 acide acétique molaire à un pH final de 4,5 à 4,7.
Laisser incuber ce mélange à température ambiante pendant deux minutes. Après cela ajouter lentement des gouttes d’un hydroxyde de potassium normal pour restaurer le pH à 7,0, transférer les cellules à 50 tubes millilitres, et les centrifuger à 600 fois g pendant 10 minutes, pour enlever toute flagelle détachée. Jeter le surnatant et conserver la pastille sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être lavée.
Une fois prêt, lavez la pastille deux fois à l’aide de 50 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius par lavage. Faites tourner la pastille lavée à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille en 30 millilitres de 1x PBS.
Ensuite, chargez lentement la suspension sur un coussin de 20 millilitres de 25% de saccharose, sans mélange. Tourner à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour enlever toute flagelle restante et étendre les cellules dans le saccharose. À l’aide d’un aspirateur, aspirez soigneusement le supernatant en ne gardant que les 20 millilitres les plus bas.
Laver le saccharose restant en ajoutant 20 millilitres de 1x PBS froid. Centrifugeuse à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius, en vous assurant qu’il n’y a pas de touffes dans la solution.
Transférer la pastille résuspendue dans une nouvelle bouteille de 250 millilitres, ajouter le tampon de lyse, complété par 5000 unités de DNase, à la bouteille contenant les cellules. Incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure, tout en mélangeant toutes les 15 minutes en inversant soigneusement la bouteille. Transférer les cellules lysées dans un tube conique et une centrifugeuse de 50 millilitres à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
À l’aide d’une pipette, recueillir le supernatant et le charger dans un tube à fond rond de 30 millilitres sur de la glace contenant deux millilitres de coussin de saccharose de 60 %. Centrifugeuse à 10 000 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Après cela, aspirer le surnatant jusqu’à un millilitre au-dessus du coussin saccharose.
Notez l’interface jaune entre le millilitre de supernatant restant, et les deux millilitres de coussin saccharose. À l’aide d’une pointe P1000 coupée, mélanger délicatement le surnatant restant avec le saccharose. Mettre en commun tous les coussins de saccharose et les conserver sur la glace.
Ensuite, préparez un gradient de saccharose de 40 % à 70 % dans un tube de polypropylène de 38,5 millilitres à paroi mince tel que décrit dans le protocole textuel. Chargez lentement les interfaces poolées dans le gradient. Équilibrez les tubes avec le tampon K-PIPES de 10 millimillons et la centrifugeuse à 68, 320 fois g et quatre degrés Celsius pendant 75 minutes.
Après cela, utilisez une aiguille de 0,8 millimètre pour faire un trou dans le fond du tube, en vous assurant de ne pas déranger les différentes couches de saccharose. Utilisez ce trou pour recueillir 12 fractions de 500 microlitres à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pointe P200 coupée, préparer un aliquot supplémentaire de 10 microlitres de chaque fraction à utiliser pendant l’immunofluorescence.
Ensuite, casser-congeler les fractions dans l’azote liquide. Pour commencer, placez un couvercle stérile de 12 millimètres sur l’extrémité inférieure encastrée du concentrateur, en vous assurant de garder le côté recouvert de PDL vers le bas. Placez l’adaptateur directement sur le dessus, pour couronner le coverslip.
Ensuite, inversez le tube à fond rond et placez-le sur le concentrateur, le coverslip et l’adaptateur. À l’aide d’une pince à épiler, poussez doucement l’ensemble jusqu’à ce qu’il atteigne le fond du tube, puis inversez le tube. Ajouter 10 millimolaires de tampon K-PIPES jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet du concentrateur.
Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le cylindre central du concentrateur. Ajouter délicatement 100 microlitres de tampon K-PIPES de 10 millimolaires à l’un des aliquots de la fraction centriolaire enrichie et bien mélanger à l’aide d’une pipette P200. Ensuite, retirez 100 microlitres de tampon K-PIPES du centre creux du concentrateur, et ajoutez 100 microlitres du mélange de fraction tampon, en vous assurant que le contenu reste au centre creux du concentrateur.
Tournez à 10 000 fois g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius. Après cela, utilisez une pince à épiler pour enlever le concentrateur. Insérez un dispositif crocheté à la main dans le trou présent dans le bord fendté de l’adaptateur et soulevez-le doucement pour récupérer le coverslip.
Une fois qu’il atteint le dessus du tube, utilisez un doigt ganté pour piéger le bord de l’adaptateur et utilisez des pinces à épiler pour enlever le coverslip, en gardant à l’esprit de quel côté de la couverture contient centrioles. Ensuite, effectuez la fixation et la coloration d’immunofluorescence des centrioles concentrées. Pour commencer, incuber les coverslips avec les centrioles dans la boîte préparée de laboratoire de transmission en polystyrène cristal rempli de 100% de méthanol à moins 20 degrés Celsius pendant 5 minutes.
À l’aide d’une pince à épiler, transférer les coverslips dans une boîte de laboratoire transparente remplie de 50 millilitres de 1x PBS. Laissez les glissières laver dans le PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, pipette 60 microlitres d’anticorps primaires se mélangent sur un morceau d’enveloppe d’étanchéité de laboratoire dans une chambre humidifiée.
Déposer délicatement les coverslips sur le dessus du mélange d’anticorps avec les centrioles directement face à la goutte. Laissez les coverslips incuber pendant 45 minutes. Après cela, retirez les coverslips et lavez-les dans une boîte contenant du PBS pendant cinq minutes.
Incuber les coverslips lavés pendant 45 minutes, avec des anticorps secondaires dans PBS 1%BSA et 0,05%Tween-20. Retirez les coverslips et lavez-les pendant cinq minutes dans une boîte contenant du PBS. À l’aide d’un support anti-décoloration régulier, monter le coverslip sur une diapositive.
Ensuite, imagez les centrioles isolés sur un microscope confocal à un objectif d’huile de 63X avec un N.A.de 1.4, tout en appliquant la déconvolution. Installez la position supérieure et inférieure de la pile Z au-dessus et au-dessous du signal centriole, respectivement, et acquérez une grande pile d’images comprenant le signal centriole total. Projeter la pile et effectuer une seule particule moyenne telle que décrite dans le protocole de texte.
L’immunofluorescence représentative révèle que six fractions sont enrichies pour les centrioles isolées, avec un pic pour la fraction numéro trois, tandis que les deux dernières fractions ne le sont pas, ce qui indique que la purification est réussie. Seulement environ 30 centrioles sont vus par champ de vision sans le concentrateur, tandis que 183 sont vus avec le concentrateur. Cela démontre que l’étape du concentrateur est réussie, et permet un enrichissement six fois des centrioles dans une région définie, ce qui facilite leur détection et leur image.
La microscopie super-résolution est ensuite utilisée pour l’image centrioles tachées pour la tubuline monoglutamylated, et le logiciel est utilisé pour générer une moyenne presque parfaite pour chaque orientation choisie. Après cinq itérations, deux classes de moyennes ont été générées de centrioles monoglutamylated : une vue supérieure de 63 objets et une vue latérale de 98 particules. La longueur de la moyenne de la classe de vue latérale est de 260 nanomètres avec un diamètre de 250 nanomètres, comparable au signal de tubuline monoglutamylated mesuré qui est vu pour se localisér dans le noyau du centriole.
Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le centriole isolé sur la glace et de les congeler après l’isolement. Suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme la microscopie cryo-électronique et la spectrométrie de masse peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, telles que l’architecture indigène du centriole ou la composition protéique centriole.
