La recherche en laboratoire des auteurs est soutenu par le National Institutes of Health subventions R37-HL041026, R01 et R01-HL086483-HL056786 (SSS) et par F32-HL097463 et T32-AR048523 (PB) du Service des Etats-Unis santé publique.

1. Soins des animaux et l&#39;utilisation Après examen et l&#39;approbation de l&#39;Institutional Animal Care et le Comité de l&#39;utilisation, la souris mâle au moins 12 semaines sont utilisées. Une souris est anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d&#39;injection. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l&#39;anesthésie est maintenue par des suppléments (10-20% de l&#39;injection initiale, ip) comme il faut (toutes les 30-60 minutes; indiqué par réaction de retrait à l&#39;orteil ou de pincer la queue). Après achèvement de la procédure expérimentale de la souris est une overdose avec du pentobarbital (ip) et euthanasiés par dislocation cervicale. 2. Micropipettes et microiontophorèse <ol><li> Micropipettes microiontophorèse (diamètre de l&#39;extrémité interne, ~ 1 um) sont préparés à partir de tubes de verre borosilicate capillaire en utilisant un extracteur de pipette horizontale. Ours ont une conicité ~ 5 mm pour la rigidité; plus cierges sont plus souples. </li><li> Micropipettes sont remblayés avec 1M ACh (Figure1A-C) dissous dans l&#39;eau 18,2 MQ. Pour le remblayage, un tube microcapillaire est connecté à filtre de 0,2 um couplée à une seringue contenant l&#39;agoniste d&#39;intérêt (figure 1). Ceux-ci peuvent être facilement fabriqués (ci-dessous) ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux. Le tube microcapillaire est inséré dans l&#39;extrémité arrière de la solution micropipette et ACh est livré dans la lumière tout en retirant le tube microcapillaire que la micropipette comble. En tenant la micropipette avec son extrémité pointant vers le bas, les bulles d&#39;air sont éliminées par un léger effleurant la micropipette. </li><li> La micropipette est fixée dans un support monté dans un micromanipulateur (figure 2). Le titulaire dispose d&#39;un fil d&#39;argent reliant la solution d&#39;ACh dans la micropipette d&#39;une broche externe, qui à son tour est relié à la borne positive d&#39;un programmeur microiontophorèse. Un fil d&#39;argent seconde déposés au bord de la préparation des tissus est connecté à la borne négative pour compléter le circuit de la pointe de la micropipette est avancé dans la solution de sérum physiologique au cours de la préparation. </li><li> Un courant de retenue est appliquée pour empêcher la vasodilatation (ou réponse fluorescente) lorsque la pointe micropipette est positionné adjacent à la paroi artériolaire. Conserver actuelle variera en fonction de la taille de la pointe micropipette (diamètre intérieur = 1 um) et la concentration agoniste mais il est hautement reproductible pour les paramètres définis (nous utilisons ~ 200 nA pour 1M ACh, une astuce um). Le courant en conservant cesse coïncide avec la livraison d&#39;éjection courant via la gâchette électronique (Figure 1 supplémentaire) synchronisée avec l&#39;apparition de l&#39;acquisition d&#39;images. </li></ol> 3. Micromanipulation <ol><li> Une plate-forme personnalisée pour une platine de microscope XY a été fabriqué en acier inoxydable ferromagnétiques. Dimensions plate-forme (1 / 8 &quot;x 12&quot; x 13 &quot;) permettent un espace suffisant pour micromanipulateurs position autour de la préparation expérimentale Micromanipulateurs désirée (figure 2A). Sécurisé aux bases magnétiques (figure 2B) permettent le positionnement comme dicté par la préparation. Ce sont placé directement sur la plate-forme fabriquée autour de la préparation pour micropipettes positionnement sur les sites d&#39;intérêt (figure 2C). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <ol><li> Avec la pointe micropipette positionnée adjacente à une artériole, il est la réponse de fluorescence à l&#39;ACh (en conservant courant que ajustées pour empêcher la fuite d&#39;ACh). Ci-dessous un stimulus seuil n&#39;y avait aucun effet. Cependant, comme l&#39;intensité du stimulus augmenté, endothéliales de fluorescence du calcium cellulaire accrue sur des distances progressivement plus long de l&#39;artériole, comme l&#39;intensité de la fluorescence sur le site de la stimulation (figure 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Méthode pour le remblayage des pipettes microiontophorèse. A) Un tube microcapillaire (flèche verte) est fixé dans un raccord de compression (flèche bleue) attaché à un filtre de 0,2 um (flèche violette) qui est ensuite attachée à une seringue remplie d&#39;1M d&#39;ACh. B) Le tube microcapillaire est introduit dans le pipette microiontophorèse travers l&#39;arrière et la solution est déplacé pour remplir la lumière de la micropipette. C) Une fois la pipette est remplie, maintenez la pointe vers le bas et tapotez doucement au-dessus du cône pour éliminer les bulles (flèche noire). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Plate-forme personnalisée pour le placement micromanipulateur. .. A) Une plate-forme en acier inoxydable ferromagnétiques a été placé sur une coutume MVX10 base de microscope contenant une platine XY translationnelle B) Circulaire bases magnétiques apposée au bas de compacte à 3 axes micromanipulateurs C) Micromanipulateurs positionné autour de la préparation expérimentale (voir protocole associé: ID # 2874 JoVE) pour l&#39;étude des sites d&#39;intérêt spécifique. L&#39;ir taille compacte et sa polyvalence permettent micropipettes multiples pour être utilisés simultanément. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fluorescence de calcium dans les artérioles. Fluorescence de calcium des cellules endothéliales tapissant la paroi artériolaire augmente avec l&#39;intensité du stimulus. Les 3 premiers panneaux montré des images des réponses de fluorescence à A) 250 nA, B) 500 nA et C) 1000 nA l&#39;éjection de courant (tous les 500 ms durée d&#39;impulsion). La distance sur laquelle la fluorescence endothéliales de calcium cellulaire accrue est indiqué par des crochets dans le CA (~ 130, 270 et 400 um, respectivement). La ligne de référence à travers l&#39;artériole dans chaque panneau indique où les réponses de fluorescence (F / Fo) à l&#39;ACh ont été enregistrées sur le site de la stimulation. D) Les enregistrements de F / Fo temps vs pour des stimuli ACh augmente. Comme d&#39;éjection courant a augmenté, F / Fo augmenté en amplitude et en durée. Notez que 100 nA de relance était en dessous du seuil et n&#39;a eu aucun effet. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Figure 1 supplémentaire" /> Figure 1 supplémentaire. Schéma pour déclenchement électronique. Ce circuit est interfacé avec un port parallèle à partir d&#39;un ordinateur personnel. Lorsque activé, il fournit une constante impulsion TTL de 5V. La puce 7805 est un régulateur de tension 5V connecté à une alimentation 9-12V DC (une batterie de tension appropriée est très bien). La sortie de la 7805 fournit la puissance à l&#39;interrupteur de quad bilatérales et à la sortie du circuit. Entrée à travers la résistance 1K est de l&#39;ordinateur.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Toutes les procédures et les protocoles impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation de l&#39;Université du Missouri et réalisée en accord avec le Guide National Institutes of Health pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. La production de cet article a été parrainé par Stanford Photonics.

Le protocole décrit ici démontre des méthodes pour préparer et mettre en œuvre pour micropipettes microiontophorèse. Livraison de l&#39;acétylcholine est utilisé pour illustrer la signalisation calcique sous-jacente vasodilatation endothélium-dépendante dans les artérioles de la souris anesthésiée. Nos résultats montrent que la distance sur laquelle l&#39;ACh augmente endothéliales cellule augmente de calcium par fluorescence avec l&#39;intensité du courant de l&#39;éjection de la micropipette microiontophorèse (figure 3). L&#39;absence d&#39;augmentation de fluorescence dans des conditions de repos indique une fuite négligeable de l&#39;ACh à partir de la micropipette. L&#39;absence de réponse de 100 nA intensité du stimulus (figure 3, la légende) montre que l&#39;intensité du seuil de stimulation est nécessaire pour le calcium des cellules endothéliales d&#39;augmenter. Ces techniques peuvent être facilement adaptée à d&#39;autres agents vasoactifs et de préparations de tissus. Des considérations pratiques: En travaillant avec d&#39;étudier la réactivité microiontophorèse artériolaire, plusieurs choses doivent être reconnus. Alors il s&#39;est avéré difficile de déterminer la concentration réelle de l&#39;agoniste de livraison, de stimulus-réponse courbes sont reproductibles à l&#39;intérieur et entre les préparations. Ceux-ci peuvent être effectuées en tenant durée d&#39;impulsion constante (par exemple, 500 ms) et en variant l&#39;éjection de courant (par exemple, 250, 500 et 1000 NA; figure 3). Alternativement, l&#39;éjection de courant peut être maintenu constant (par exemple, 500 nA) et la durée d&#39;impulsion variés (par exemple, 250, 500 et 1000 ms). Pour une référence à l&#39;action d&#39;une concentration d&#39;agoniste défini, la préparation peut être perfusées avec la solution appropriée 5. Parce que la force motrice de l&#39;éjection soluté est le mouvement de charge électrique, l&#39;agent d&#39;être livré doit porter une charge nette d&#39;être déplacés de la micropipette. Afin de s&#39;assurer que l&#39;agent d&#39;intérêt est le porteur de charge primaire, il est dissous à une concentration élevée (par exemple, 1 M pour l&#39;ACh) pour minimiser l&#39;électro-osmose. Lorsque cela nécessite de manipuler le pH de la solution de remplissage micropipette, les contrôles de véhicules sont tenus d&#39;établir tous les effets non spécifiques. Des contrôles appropriés doivent aussi être effectués pour le passage du courant seul (par exemple, en utilisant des micropipettes remplies de solution saline isotonique). La distance efficace pour la diffusion de l&#39;agent de son site de libération doit être déterminée et est plus facilement déterminée empiriquement par la disparition d&#39;une réponse physiologique (par exemple, la vasodilatation ou une augmentation du calcium intracellulaire lors de l&#39;éjection de l&#39;ACh) comme la micropipette est positionné à défini distances du site cible. En pratique, la distance de diffusion efficace est grandement influencée par la manière dont la pointe de la micropipette est positionné dans le tissu, par exemple si la pointe enfoncée dans le tissu et son extrémité est obstruée, que l&#39;éjection est altérée. Excessive de tissu conjonctif est particulièrement gênant et devrait être retiré de la surface du tissu lors de la préparation chirurgicale. Une attention particulière devrait également être accordée à la possibilité d&#39;épuiser la pointe de l&#39;agent désigné. Ceci est minimisé en utilisant des impulsions relativement courtes (par exemple, ≤ 1 s). Avec des courants soutenus (par exemple, plusieurs secondes), l&#39;agoniste peut être expulsé de la pointe plus rapidement qu&#39;elle ne peut être remplacée par la diffusion de la solution en vrac de remplir la micropipette. Parce volume négligeable est déplacée par microiontophorèse, si l&#39;on essaie de changer le milieu local ioniques (par exemple, de livrer un K dépolarisants relance +), cela ne peut être efficacement réalisé avec microiontophorèse mais il est facilement atteint avec l&#39;éjection de pression de liquide en vrac ayant le désiré composition. Pour la stimulation locale d&#39;une artériole, conseils micropipette avec un diamètre intérieur de 2-3 um bien travailler avec la pression d&#39;éjection 4-5 psi (28-35 kPa) et la durée d&#39;impulsion (par exemple, 1 seconde) contrôlée par une électrovanne 10. Si la livraison soutenue d&#39;un agent d&#39;une micropipette sur une microvaisseaux est nécessaire, l&#39;éjection pression est préféré à l&#39;aide des micropipettes diamètre de l&#39;extrémité interne appropriée (par exemple, ~ 10 mm) 11,12. Une colonne hydrostatique de hauteur connue avec une vanne robinet fournit un moyen peu coûteux, bien définie sur / la tête de pression constante. Les débits sont déterminés par le diamètre interne de la pointe de la pipette et la pression de conduite. Comme toujours, les contrôles de véhicules sont indispensables pour exclure les actions non spécifiques de l&#39;éjection de pression.

<table><tbody><tr><td> Matériel usagé </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Tubes en verre borosilicate capillaire </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extracteur horizontal pipette </td><td> Sutter Instruments </td><td> modèle P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure d&#39;acétylcholine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> adaptateur pour Luer concentrateur </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Pour sécuriser tube microcapillaire </td></tr><tr><td> 0,2 um Nylon Titan filtre </td><td> Dim. Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Faible volume de rétention pour minimiser les pertes </td></tr><tr><td> Seringue de 5 ml </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-pipette </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Fil d&#39;Argent </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> Diamètre 0.25mm </td></tr><tr><td> 3-axes micromanipulateur </td><td> Siskiyou concevoir des instruments </td><td> DT3-100, MXB, MXC, BTP / 8 </td><td> Composants pour manipulateurs comme le montre </td></tr><tr><td> programmeur microiontophorèse actuelle </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Modèle 260 </td><td></td></tr><tr><td> dispositif de déclenchement </td><td> Personnalisé </td><td> personnalisée </td><td> circuit fourni au Suppl. Figure 1 </td></tr><tr><td> plaque en acier inoxydable </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Selon la conception </td></tr><tr><td> Intensification Appareil Photo Numérique </td><td> Stanford Photonics Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Intégré avec Piper logiciel de contrôle </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophorèse implique le passage du courant à travers une pointe de micropipette pour livrer un soluté dans un site désigné au sein d&#39;une préparation expérimentale. Microiontophorèse peut simuler une transmission synaptique en offrant neurotransmetteurs et des neuropeptides sur les neurones de façon reproductible 2. Volume négligeable (fluide) évite le déplacement des perturbations mécaniques pour la préparation expérimentale. Adapter ces techniques pour la microcirculation 3 a permis à des mécanismes de la vasodilatation et la vasoconstriction d&#39;être étudiée au niveau microscopique in vivo 4,5. Un avantage clé de la prestation est localisée permettant réponses vasomotrices d&#39;être étudié sur des sites définis au sein d&#39;un réseau microvasculaire sans évoquer les changements systémiques ou réflexive de la tension artérielle et la circulation sanguine des tissus, révélant ainsi des propriétés intrinsèques des microvaisseaux. Une limitation de microiontophorèse est que la concentration précise de l&#39;agent livré sur le site d&#39;intérêt est difficile à déterminer 6. Néanmoins, sa sortie de la pointe de micropipette est proportionnelle à l&#39;intensité et la durée de l&#39;éjection actuelle 2,7, de sorte que reproductibles relations stimulus-réponse peut être facilement déterminée sous des conditions expérimentales définies (décrites ci-dessous). D&#39;autres facteurs influant sur la prestation microiontophoretic comprennent concentration en soluté et son ionisation en solution. Le diamètre interne de l&#39;embout micropipette devrait être ~ 1 mm ou moins à minimiser diffusionnels «fuite», qui peut être contrarié avec un courant de retenue. Ainsi, un étranger (positif) actuelle est utilisée pour éjecter un cation et un courant négatif utilisé pour le conserver au sein de la micropipette. La fabrication des micropipettes est facilitée avec extracteurs sophistiqués électronique 8. Micropipettes sont tirés de tubes capillaires en verre contenant un filament que «mèches» solution dans l&#39;embout de la micropipette quand il est rempli de l&#39;extrémité arrière («remblayer»). Cela se fait par l&#39;insertion d&#39;un tube microcapillaire reliée à une seringue contenant la solution de l&#39;intérêt et l&#39;éjection de la solution dans la lumière de la micropipette. Micromanipulateurs permettent de placement souhaitée de micropipettes au sein de la préparation expérimentale. Micromanipulateurs monté sur une base mobile peut être positionnée autour de la préparation selon la topographie des réseaux microvasculaires (développé ci-dessous). Le présent protocole démontre microiontophorèse de l&#39;acétylcholine (ACh + Cl -) sur une artériole de la préparation de la souris crémaster (Voir associés protocole: ID # 2874 JoVE) pour produire endothélium-dépendante vasodilatation. La livraison de stimulation est synchronisée avec l&#39;acquisition d&#39;images numérisées à l&#39;aide d&#39;un déclencheur électronique. L&#39;utilisation de BAC-CX40 GCaMP2 9 souris transgéniques permet la visualisation des réponses calcium intracellulaire qui sous-tendent la vasodilatation artériolaire dans les cellules endothéliales de la microcirculation de vie.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophorèse entraîne le mouvement des ions à partir d&#39;une micropipette en réponse à une différence de potentiel électrique entre l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de la micropipette. Molécules biologiquement actives sont ainsi livrées en proportion de courant électrique. Nous illustrons microiontophorèse acétylcholine en conjonction avec micromanipulation pour étudier endothélium-dépendante la vasodilatation de la microcirculation.

Microiontophorèse et la micromanipulation pour l&#39;imagerie de fluorescence intravitale de la microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K vues.  University of Missouri. Microiontophorèse entraîne le mouvement des ions à partir d'une micropipette en réponse à une différence de potentiel électrique entre l'intérieur et l'extérieur de la micropipette. Molécules biologiquement actives sont ainsi livrées en proportion de courant électrique. Nous illustrons microiontophorèse acétylcholine en conjonction avec micromanipulation pour étudier endothélium-dépendante la vasodilatation de la microcirculation.

Vidéo: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Normalisation Né pour tomographie par fluorescence de projection optique pour l&#39;imagerie cardiaque entier

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Recherche

Biologie

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

La préparation de la souris crémaster pour l&#39;imagerie intravitale de la microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolement et imagerie de Fluorescence pour la Reconstruction de la particule de Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...