Ce protocole est basé sur les techniques apprises dans le laboratoire de Francis-André Wollman à la France Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris,. Les auteurs ont une dette de gratitude à Jacqueline Girard-Bascou, qui avait initialement introduit DBS aux techniques de Chlamydomonas génétique. Chlamydomonas la recherche dans le laboratoire de l&#39;auteur »est soutenu par la National Science Foundation récompense MCB-0646350.

Partie 1: Préparation des souches pour la gamétogenèse Remarque: Toutes les manipulations doivent être effectuées à température ambiante. Températures supérieures ou inférieures auront une incidence sur la vitesse de germination zygote et peuvent nuire à la viabilité. Considération importante: Il est essentiel que des souches à croissance robuste sont accouplés et sont libres de contamination des champignons ou des bactéries. Si les souches n&#39;ont pas été transférés régulièrement, le passage sur milieu riche devrait précéder la génération de gamètes. <ol><li> Les souches d&#39;être accouplés sont transférés sur des plaques TAP (100 × 15 mm), 1-2 souches par plaque. Les cellules doivent être cultivées dans une bande de concentrés d&#39;environ 1 cm de largeur. </li><li> L&#39;incubation des plaques TAP devrait se poursuivre jusqu&#39;à une épaisse couche de cellules à croissance robuste est présent, avec des transferts intermédiaires si nécessaire. Les souches qui n&#39;ont pas été récemment repiquées peut exiger un passage et un total de 1 semaine, alors que les souches de type sauvage en usage régulier ne peut prendre de quelques jours et pas de passages. Mutants qui sont sensibles à la lumière peut exiger un délai supplémentaire. </li><li> Transfert de toutes les cellules de la TAP pour les plaques plaques N10, qui sont déficientes pour l&#39;azote et va commencer à induire la gamétogenèse. Transférer les cellules comme une dalle épaisse, un peu comme ils étaient présents sur la plaque de la TAP. Cela facilitera la collecte ultérieure des cellules. Après 3 jours sur la N10, les cellules sont prêtes à subir la gamétogenèse. La division cellulaire va être lent sur N10, mais les cellules doivent rester vert foncé. Toute souches contaminés doivent être jetés comme des zygotes viables ne sera pas obtenu. </li></ol> Partie 2: L&#39;accouplement <ol><li> Chaque souche est transféré dans un erlenmeyer de 50 ml et remises en suspension dans environ 2,5 ml d&#39;eau distillée stérile. Cela peut être fait soit en utilisant une boucle de fil ou un bâton stérile; ce qui est important est que les cellules sont bien suspendues et non en touffes. Le volume exact d&#39;eau doit être ajustée de sorte que la concentration cellulaire, comme mesuré par l&#39;œil, est sensiblement le même pour chaque souche. </li><li> Les cellules sont agités sous une forte lumière (1,260 E μ / m 2 / s) pendant 2 heures, temps pendant lequel les cellules deviennent les gamètes mobiles. Mobilité doit être vérifié au microscope optique. Si les gamètes sont la natation mal, l&#39;accouplement est susceptible d&#39;être inefficace. Cependant, même mal souches mobiles s&#39;accouplent une fréquence réduite. </li><li> Ensuite, des volumes égaux de mt + et MT-gamètes sont combinés en un seul flacon 50 ml. Les gamètes sont de gauche, sous une forte lumière (1,260 E μ / m 2 / s) sans agitation. </li><li> L&#39;accouplement peut être vérifiée immédiatement sous le microscope optique. Paires de gamètes se forment rapidement, et apparaîtra comme les cellules se déplaçant rapidement rejoint à la flagelle. Si l&#39;accouplement semble être extrêmement rapide, les échantillons doivent être prises dans les 30 min -1 hr pour la génération des zygotes. Si non, l&#39;accouplement peut être vérifié à chaque heure, bien que ceci est optionnel. Depuis les temps donnant la densité optimale des zygotes varient largement entre les croix, il est préférable de prendre des aliquotes du mélange d&#39;accouplement à différents moments après la combinaison des gamètes, par exemple après 1 h, 2 h, 3 h et 4 heures. Cela se fait en transférant 300 échantillons uL à TAP-3% de gélose Difco 60 x 15 mm plaques; taches 3-4 par assiette. Attention à ne pas agiter le mélange d&#39;accouplement, car cela pourrait perturber les paires d&#39;accouplement. Gélose Difco est utilisé parce qu&#39;il a moins de contaminants que bas prix géloses, et il sera plus facile de voir zygotes sous le microscope. Le mélange d&#39;accouplement inutilisée peut être laissé dans le ballon pendant la nuit, et la qualité de la réaction de l&#39;accouplement sera évident le jour suivant. Lorsque l&#39;accouplement est efficace, les zygotes se conformer au mur ou au fond du flacon et le milieu apparaissent clairement. Même l&#39;agitation de la fiole ne parviendra pas à déloger les zygotes. Si rien ne colle à la vitre quand le mélange est agité avec force raisonnable, alors l&#39;accouplement a été inefficace ou n&#39;a pas eu lieu. </li><li> Les plaques TAP-Difco contenant un mélange d&#39;accouplement sont séchées dans une hotte stérile, avec les couvercles entrouverte, jusqu&#39;à ce que tout liquide de surface a été absorbé. Les plaques sont généralement laissés à la lumière (700 E / m 2 / s) pour 18 heures, puis enveloppés dans une feuille, car la maturation zygospore n&#39;aura lieu que dans l&#39;obscurité. Les souches franchi, l&#39;accouplement heure et la date sont écrites sur les plaques et le papier d&#39;aluminium. Les plaques sont stockées 5 à 7 jours et peuvent être conservés plus longtemps, bien que l&#39;efficacité de germination zygote diminue progressivement. </li></ol> Partie 3: Dissection Tétrade <ol><li> Cellules végétales doivent être grattées taches sèches du mélange d&#39;accouplement avec une lame émoussée, comme un scalpel. La lame peut être utilisée pour exposer une zone de zygotes, qui collera bien à l&#39;agar à 3%. Cette étape se fait habituellement dans l&#39;après-midi, de sorte que les zygotes ont germé dès le lendemain matin, mais n&#39;ont pas subi une seconde, la division végétative quirendement de 8 progéniture. biologistes Chlamydomonas rapidement apprendre à reconnaître les zygotes sous le microscope, car elles sont plus grandes que les cellules végétatives, et disposent d&#39;un mur épais zygospore qui donne un contour noir. Zygospores apparaissent souvent jaune, mais peut aussi être un peu vert. Le personnage le plus important est qu&#39;elles collent à la gélose, tandis que les cellules végétatives sont facilement écarté. Cependant, si les plaques sont trop sec ce ne sera pas le cas. Aussi, si le mélange d&#39;accouplement était trop dense, les zygotes peuvent former un tapis qui fera le transfert de zygotes individuels difficiles, voire impossibles. Densités appropriées sont établies à l&#39;étape 2.1, et sera vite appris avec l&#39;expérience. </li><li> Aiguilles de verre sont préparés pour recueillir les zygotes et séparant la descendance tétrade. Ce sont préparés en tirant 3 tiges de verre mm dans une petite flamme pour produire un long fil mince, qui peut être rompu. Les pointes de ces extrémités effilées sont lissées ou plié en crochets, en chauffant dans une flamme brève faible (par exemple l&#39;alcool ou une allumette en feu). Préparer 3 ou plus des aiguilles de verre, car ils cassent assez facilement, surtout pour les utilisateurs inexpérimentés. </li><li> Zygotes sont rassemblés sur les 3% de TAP-Difco plaque à l&#39;aide d&#39;une aiguille de verre dans un petit tas. Un carré de gélose (jusqu&#39;à 0,5 cm 2) contenant les zygotes est formé et excisées en utilisant une sourde scalpel. Ensuite, le bloc d&#39;agar est placé face cachée sur un 15 mm 1,5% TAP-Difco plaque, et a glissé le long d&#39;une ligne horizontale d&#39;environ 1,5 cm du haut de la plaque, pour distribuer les zygotes. La ligne horizontale supérieure, et une grille d&#39;environ 1,5 cm de l&#39;espacement horizontal et 0,5 cm verticaux sont gravés dans le dos des plaques. La grille sera utilisée le jour suivant comme guide pour la séparation de la descendance tétrade (la grille peut également être gravé le jour de dissection). Enfin, les zygotes individuels sont passer à l&#39;intersection des lignes horizontale supérieure avec chaque ligne verticale, avec environ 20-30 zygotes par plaque. Bien que seulement 12 ou plus sera disséqué, ne sont pas tous zygote germe, et certains vont diviser deux fois avant d&#39;éclater, les zygotes afin supplémentaires sont nécessaires. </li><li> Après avoir distribué les zygotes, et les cellules végétatives qui ont été accidentellement transférée de la plaque de gélose à 3% sont tués en exposant la plaque retournée pendant 30 secondes sur un plat en verre contenant une mince (1-2 mm) couche de chloroforme. La distance entre la plaque et le chloroforme devrait être d&#39;environ 5 cm. Si trop de chloroforme est utilisé, ou si la distance est trop petit ou grand, on risque soit de tuer les zygotes, ou ne pas tuer les cellules végétatives. Le traitement au chloroforme doit être effectuée immédiatement après la zygospores ont été distribués sur la plaque de la germination, pour assurer la sélectivité. </li><li> La germination prend 16-20 heures pour la plupart des souches, mais varie avec le génotype et l&#39;âge des zygotes. Pour la germination, les plaques sont placées sous un faible éclairage (239 E / m 2 / s), ou dans la lumière estompée moyennes en couvrant la plaque avec un tissu. </li><li> Zygotes germées peuvent être identifiés au microscope que les cellules gonflées ou parfois éclater avec des cellules filles à l&#39;intérieur. Si la zygospore n&#39;a pas rompu, touchant légèrement avec une aiguille de verre se brisera le mur si la germination s&#39;est produite. Les cellules filles sont doucement traînés aux points de grille ci-dessous le zygote. Il est plus facile de faire cela en capturant les cellules dans une petite quantité de milieu liquide libéré de la gélose par la pression de l&#39;aiguille de verre, et en faisant glisser cette «flaque» derrière l&#39;aiguille. Une forme de «assurance» que l&#39;on a disséqué un zygote et non une cellule végétative qui a deux fois divisés, c&#39;est qu&#39;à part les cellules fille de quatre, la «peau» du mur zygospore restera. </li><li> La progéniture disséqués sont cultivés dans des conditions appropriées jusqu&#39;à clonies visible peut être choisi pour une analyse ultérieure. Les plaques doivent être surveillés quotidiennement pour la contamination. </li></ol> Remarque: la génération des diploïdes végétative ne sont pas couverts ici, mais consiste essentiellement plaquage le mélange d&#39;accouplement sur le milieu qui ne favorise pas la croissance de la souche parentale soit, mais de soutenir la croissance du diploïde (par exemple, deux marqueurs différents auxotropic). Les plaques sont conservées dans la lumière pour éviter la formation de zygotes.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;analyse génétique est simple chez Chlamydomonas, mais elle nécessite des techniques particulières pour générer des gamètes et la progéniture tétrade séparé. Avec les souches saines, les techniques sont facilement acquises. Avec certaines souches mutantes, il devient de plus d&#39;un art, et les lecteurs doivent se reporter tome 1 du Sourcebook publié récemment des Chlamydomonas notes historiques et des conseils pratiques. Par ailleurs, il convient de noter qu&#39;il ya beauc...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

L&#39;algue verte unicellulaire<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Est devenu un organisme populaire pour la recherche dans divers domaines de la biologie cellulaire et la génétique en raison de son cycle de vie simple, la facilité de croissance et de manipulation pour l&#39;analyse génétique, les ressources génomiques et transformabilité du noyau et les deux organites. Souches accouplement est une pratique courante lors des approches génétiques sont utilisés dans<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, De créer des diploïdes végétative pour l&#39;analyse de la domination, ou suite à une dissection de tétrade d&#39;héritage nucléaire vs organelles vérifier, de tester allélisme, d&#39;analyser epistasy, ou de générer des populations dans le but d&#39;une carte basée sur le clonage. En outre, les croisements génétiques sont couramment utilisés pour combiner les génotypes organelles avec notamment des génotypes nucléaires. Ici nous démontrons des méthodes standard pour la gamétogenèse, l&#39;accouplement, la germination et la séparation zygote tétrade. Ce protocole consiste en une série facile à suivre des étapes qui feront des approches génétiques se prêtent à des scientifiques qui sont moins familiers avec<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Les paramètres clés et les points chauds sont expliquées. Enfin, les ressources pour plus d&#39;informations et les méthodes alternatives sont fournies.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

L&#39;accouplement et la séparation des tétrades sont nécessaires pour l&#39;analyse génétique dans<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Ici nous démontrons des méthodes standard pour la gamétogenèse, l&#39;accouplement, la germination et la dissection de tétrade zygote. Ce protocole consiste en une série facile à suivre des étapes qui feront des approches génétiques se prêtent à des scientifiques qui sont moins familiers avec<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

L&#39;accouplement et la séparation des Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Pour l&#39;analyse génétique

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K vues.  Cornell University. L'accouplement et la séparation des tétrades sont nécessaires pour l'analyse génétique dans Chlamydomonas reinhardtii. Ici nous démontrons des méthodes standard pour la gamétogenèse, l'accouplement, la germination et la dissection de tétrade zygote. Ce protocole consiste en une série facile à suivre des étapes qui feront des approches génétiques se prêtent à des scientifiques qui sont moins familiers avec Chlamydomonas

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Test de transition clair / foncé pour souris

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Recherche

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection de l&#39;hippocampe gyrus denté de souris adulte

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...