Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la pathophysiologie de l’athérosclérose précoce chez la souris. Le principal avantage de cette technique est l’efficacité, la rapidité avec laquelle l’aldostérone induit le développement de plaques d’athérosclérose dans la croissance adulte. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes techniques sont difficiles à apprendre par l’enseignement du texte seul.
Caterina Mammi, scientifique de mon laboratoire, démontrera la procédure. Portant des gants chirurgicaux, fixez le tube de remplissage de la mini-pompe à une seringue d’un millilitre et chargez le tube de 125 microlitres de l’aldostérone ou de la solution du véhicule. Insérez le tube de remplissage à travers le trou en haut de la mini-pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse pas avancer plus loin et remplir lentement la pompe avec la solution d’aldostérone.
Arrêtez de remplir la pompe lorsqu’une perle de liquide sort du corps de la pompe et retirez soigneusement le tube de remplissage. Insérez le régulateur de débit dans le corps de la mini-pompe, en prenant soin que le régulateur est ensemencé étroitement contre le corps de la pompe et amorcer la pompe remplie dans un bécher contenant une solution saline stérile à 37 degrés Celsius, jusqu’à 24 heures avant l’implantation. Pour implanter les pompes, utilisez un rasoir pour enlever les cheveux du site chirurgical et désinfecter la peau exposée avec 70% d’alcool isopropylique imbibé, matériau de garniture non tissé.
Ensuite, faire une incision de 0,8 à un centimètre à travers la peau, mais pas les tissus sous-jacents et utiliser des forceps pour ouvrir l’incision. À l’aide d’une trocarte dans l’autre main, étendre la peau pour créer une poche pour la pompe de l’incision vers l’omoplate et insérer la pompe dans l’incision, avec la tête du régulateur orientée vers l’avant de la souris, poussant doucement la pompe complètement dans la poche de sorte qu’il y ait assez de peau pour fermer la plaie sans tension ou étirement. Une fois que la pompe a été insérée, suture de l’incision avec du fil de chirurgie et utiliser un écouvillon propre pour appliquer topique, 10% pommade à l’iode povidone.
Ensuite, laissez la souris récupérer sur une phase de réchauffement avec la surveillance jusqu’à la pleine récumbence. Au point d’extrémité expérimental approprié, perfuser la souris par le ventricule gauche à l’aide de la perfusion par gravité avec 10 à 15 millilitres de DPBS glacé, suivi de 40 à 50 millilitres de 10% de formule tamponnée neutre. Après 10 à 20 minutes, placez la souris au microscope stéréo et utilisez des forceps et des ciseaux pour éliminer l’excès de tissu adipeux périiaortique et péricardique.
Tenez le cœur fixe avec des forceps et coupez perpendiculairement à l’accès à l’arc aortique, aussi étroitement que possible au cœur, sans causer de dommages. Une fois que le cœur a été séparé de l’aorte, utilisez un scalpel pour couper transversalement le long d’une ligne droite, en joignant les points inférieurs de l’atrium droit et gauche et remplissez la partie supérieure du cœur ouvert avec un composé optimal de température de coupe. Placez le tissu réséqué avec un moule en plastique cryo-section avec l’axe de l’aorte placé perpendiculairement à la base du moule rectangulaire et couvrez le tissu avec l’OCT frais.
Rétroéclairez le moule pour s’assurer que le tissu est correctement orienté, puis placez soigneusement le moule sur une plaque en métal sur la glace sèche, enveloppant le moule entier avec du papier d’argent pour moins 80 degrés Celsius de stockage lorsque l’OCT devient blanc. Lorsque le cryo-stat atteint moins 20 degrés Celsius, montez le bloc cardiaque gelé sur le porte-spécimen avec le ventriculaire orienté vers l’extérieur et insérez le porte-spécimen dans la tête orientée vers le spécimen. Ajustez l’orientation du porte-spécimen pour sectionner le bloc avec la racine aortique perpendiculaire à la lame et coupez le bloc jusqu’à ce que la racine aortique soit atteinte.
Recueillir des sections en série sur des diapositives en verre, en surveillant le profil anatomique des racines aortiques, jusqu’à ce que les trois valves aortiques apparaissent. Puis recueillir six à huit, 10 sections micromètres d’épaisseur ou jusqu’à ce que l’une des trois valves disparaît ou n’est plus intacte. Pour les taches de graisse neutres O rouge pétrole, fixer les sections en 70 millilitres de formaldéhyde de 37% pendant cinq minutes, suivie d’un lavage complet dans l’eau du robinet.
Après deux à trois minutes, éponger l’eau d’accès et tacher les sections en 70 millilitres de 0,3% d’huile rouge O pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, laver les glissières dans l’eau du robinet pendant 10 minutes et tacher les cellules pendant une minute dans 70 millilitres d’hématoxyline de Meyer, suivie d’un lavage à l’eau d’une minute et d’une émeersion d’une minute dans 70 millilitres de carbonate de lithium de 0,5 %. Ensuite, lavez les cellules dans l’eau pendant une dernière minute et montez les sections avec un milieu de montage aqueux pour l’imagerie par microscopie légère.
Après quatre semaines de traitement, les souris knock-out d’apolipoprotéine-E ont montré une augmentation significative de la teneur en lipides, comparée aux animaux témoins-sauvages de type. En outre, le traitement d’aldostérone augmente la teneur en macrophage chez les animaux knock-out comme en témoigne la coloration mack-3 et indiquant une plaque athérosclérostique plus enflammée chez ces animaux par rapport aux souris traitées par véhicule. Cependant, le traitement d’aldostérone ne modifie pas la teneur en collagène des plaques athéroclérotiques.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que cette méthode est validée seulement pour les souris apolipoprotéines qui sont naturellement enclines à développer l’athérosclérose une fois alimentées un colorant athérogénique. Par conséquent, il ne peut pas être appliqué à différents modèles animaux. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’infra-coloration peuvent être effectuées pour caractériser l’athérosclérose dans d’autres régions aortiques et quantifier le total de la charge athéroclérotique.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’athérosclérose pour explorer le mécanisme tôt de l’athérogenèse, tel que l’inflammation et la disfunction endothéliale. N’oubliez pas que le travail avec des composés volatils tels que l’isophane et la formaline peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d’un masque facial de laboratoire de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
