Pour cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de l’inflammation et l’immunologie. Par exemple, quel est le mécanisme moléculaire de l’adhérence des leucocytes et de la migration trans-endothéliale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une discrimination d’utilisation illimitée entre la transmigration et l’ajout fort de monocytes à la monocouche endothéliale.
Bien que cette méthode fournit des informations sur le recrutement de monocytes sur le flux, elle peut également être adaptée à d’autres cellules des systèmes hématopoïétiques tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, ou les dérivés de leur sous-population. Après lavage, étiquetez les cellules endothéliales ombilicales humaines ou HUVEC avec 30 microlitres de 37 degrés Celsius M199 moyen complété par un micromolaire CMFDA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec 150 microlitres de m199 complet moyen et incuber la culture dans 150 microlitres de m199 frais complet moyen pendant encore 30 minutes.
Remplacez ensuite le supernatant par 150 microlitres de support M199 complet contenant les suppléments expérimentaux appropriés et retournez la culture de chambre à glissière à l’incubateur pendant six heures. Pour l’isolement humain de monocyte de PAN, diluez un échantillon de sang fraîchement rassemblé dans PBS complété avec un EDTA millimolar à un rapport un à un et superposez soigneusement 20 ml de la solution de sang sur 20 ml de milieu de gradient de densité pour la séparation de gradient de densité par centrifugation. Recueillir la couche de plaquette cellulaire mononucléaire périphérique moyenne dans un nouveau tube de 50 ml contenant 40 ml de PBS complété par 1 millimolaire EDTA et porter le volume final à 50 ml avec PBS-EDTA supplémentaire Après comptage, isoler les monocytes avec le kit d’isolation des monocytes PAN selon les instructions du fabricant.
Et laver les cellules trois fois en M199 moyen complété par 0,5%Bovine Sérum Albumin, ou BSA, pour éliminer toute trace d’EDTA. La qualité de l’isolement des monocytes est essentielle pour assurer un résultat de transmigration et d’adhérence robuste. Il est donc important de suivre strictement la recommandation du fabricant pour l’isolement.
Resuspendez la pastille à une concentration de 6 fois 10 à 6 monocytes par ml dans le milieu frais M199 complété par 0,5%BSA et divisez les cellules en un aliquot de 200 microlitres par tube de microcentrifugeuse par essai de recrutement. Placez ensuite les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes avant leur injection dans la chambre d’écoulement. Pour préparer le système fluidique pour l’analyse, insérez d’abord un connecteur luer mâle dans une extrémité d’un tube en silicone de 8 cm de long de 3 mm d’épaisseur et connectez l’autre extrémité à un ensemble d’injection de luer en ligne.
Connectez ensuite le connecteur luer à une extrémité d’un tube en silicone de 40 cm de long de 3 mm d’épaisseur. Ensuite, la seringue de 20 mm à une extrémité d’un morceau de tube en silicone de 1 m de long de 3 mm d’épaisseur et insérer un connecteur luer mâle à l’autre extrémité. Puis insérez les deux connecteurs luer masculins dans un coupler femelle de serrure de luer et placez l’extrémité libre du tube de silicone dans un réservoir de 37 degrés Celsius M199 moyen complété avec 0.5%BSA.
Rétractez le piston pour remplir le tube d’un tampon d’écoulement et fixez la seringue sur la pompe à seringues. Réglez ensuite la pompe sur le mode de retrait et spécifiez le débit. Pour connecter la chambre de glissement, serrez le tube de silicone autour du coupler femelle de serrure de luer et déconnectez les deux mâles de connecteur de luer du coupler pour leur permettre d’être reliés au réservoir de la glissière.
Les bulles d’air perturbent non seulement la qualité de l’image, mais induisent également un stress capillaire aux cellules, conduisant à la mort cellulaire. Pour éviter les bulles d’air, confirmez le serrage correct du tube avant d’insérer le luer dans le réservoir. Retirez ensuite les pinces pour confirmer que la connexion ne fuit pas et placez la lame sous le microscope.
Pour l’imagerie du recrutement des monocytes sous flux, ajouter 5 microlitres d’anticorps anti CD16 conjugués à la flourescence et un colorant nucléaire approprié à chaque monocyte aliquoted pour une incubation de 10 minutes à température ambiante et recueillir les cellules avec une brève centrifugation. Resuspendez la pastille en 250 microlitres de tampon d’écoulement et démarrez la pompe à seringues. Ajouter 30 microlitres d’une suspension monocyte à une chambre de la lame et sélectionner l’objectif 40X sur le microscope confocal.
Activez les lasers fluorescents appropriés et utilisez la chambre avec le monocyte étiqueté pour définir les paramètres d’acquisition du microscope confocal Suivant, sélectionnez trois champs de vision dans un rayon d’un demi-centimètre pour l’imagerie confocale multi position, et réglez une pile Z à la gamme de 10 à 12 micromètres et l’acquisition time lapse pour fonctionner toutes les une minutes. Après trois minutes d’imagerie, injectez 200 microlitres de monocytes par le port d’injection de luer en ligne et commencez à imagerier l’interaction cellulaire. Après au moins 30 minutes, arrêtez l’imagerie et le débit et serrez le tube pour lui permettre d’être déconnecté de la glissière.
Pour déterminer le taux de transmigration des cellules à travers les HUVECs stimulés, ouvrez l’image J et comptez le nombre total de monocytes adhérents dans chaque champ pour déterminer le nombre de cellules par millimètre carré. Comptez ensuite le nombre de monocytes transmigrés présents dans le plan basal sous les cellules endothéliales identifiés par la présence d’une zone de trou noir autour du noyau. Une manière simple de vérifier l’état d’activation des HUVECs après stimulation est de visualiser leur allongement sous le stress inflammatoire.
L’imagerie confocale time lapse permet la visualisation des monocytes au plan apical où leur phénotype peut être évalué. Les cellules migratrices en transmigration se déplacent vers la jonction intercellulaire de cellule à cellule avant de disparaître du plan apical et de réapparaître dans le plan basal. La quantitation du recrutement des monocytes au fil du temps confirme que l’adhérence des monocytes est suivie de la transmigration.
Le taux de transmigration du monocyte positif CD16 est faible lorsque la cellule endothéliale n’est stimulée par tnf alpha que, mais augmente lorsque les cellules endothéliales sont stimulées à la fois par le TNF alpha et le facteur de croissance endothéliale vasculaire ou vegfa. La stimulation HUVEC avec TNF alpha et TNF alpha plus VEGFA induit une augmentation de l’adhérence aux cellules T, B et NK négatives CD14, par rapport aux monocytes positifs CD14. En outre, la stimulation HUVEC induit la transmigration de la population de monocytes seulement, car les cellules T, B et NK ne transmigrent ni dans les conditions stimulantes TNF alpha ou TNF plus VEGFA.
Pour effectuer un test de recrutement optimal des monocytes, il est important que vous planifiez votre expérience à l’avance et que vous le faisiez le même jour. Et lorsque vous purifiez les cellules, assurez-vous que votre microscope est à 37 degrés de sorte que vous ne transférez pas les cellules à une température différente pendant l’expérience. Pour apprendre cette procédure, toutes les méthodes comme le profilage de la cytokine huvec et l’expression de la chimiokine ainsi que des études de chimiotaxis peuvent être effectuées pour répondre à une question supplémentaire sur le mécanisme moléculaire qui soutiennent la transmigration et l’adhérence d’une population spécifique de monocytes.
