Cette méthode peut aider à l’étude des protéines membranaires telles que les transporteurs et les canaux. L’information sur la perte de taux de rotation du substrat comparant l’activité et la spécificité des protéines et les différentes conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle minimise les variations potentielles de décalage et les conditions tampons sans chlorure.
Et augmente considérablement la précision de la détermination du taux de roulement en raison de mesures plus précises du potentiel membranaire. Rassemblez les éléments pour les marches du poing. Il s’agit notamment de deux pointes de pipette micro-capillaires, d’une lame tranchante et d’un étrier coulissant.
Pour l’électrode ont fil d’argent, papier de sable et une solution de chlorure de potassium trois molaire à portée de main. En outre, avoir de l’éthanol et de l’eau pour le nettoyage et une alimentation électrique DC. Procédez en travaillant avec les deux pointes de micro-pipette.
Commencez par la pointe qui contiendra le tampon. Placez la deuxième pointe à côté de la première. Déplacez la deuxième pointe, de sorte que, lorsqu’il est inséré, sa partie étroite s’étendra d’au moins cinq millimètres dans la partie étroite de la première.
Marquez la position où le premier tampon contenant la pointe sera fixé. Ensuite, utilisez l’étrier pour mesurer la longueur de l’électrode micro-agar pont de sel. Utilisez la lame pour couper la pointe à la longueur appropriée.
Nettoyez la surface coupée avec de l’éthanol suivi de l’eau. Ensuite, obtenez une longueur d’environ huit centimètres de fil d’argent pour l’électrode. Nettoyez le fil sur les lingettes avec de l’éthanol suivi de l’eau.
Après le nettoyage, utiliser du papier de sable pour lisser la surface sur une longueur d’un centimètre à une extrémité. Ce fil à l’extrémité lissée est prêt à être recouvert d’électrochimie chimique. Mettez l’extrémité lissée dans la solution de chlorure de potassium avec l’autre extrémité reliée à une alimentation de DC pour le revêtement.
Lorsqu’il est enduit, déconnecter l’électrode et la nettoyer avec de l’eau. Après l’avoir sèche, déterminez la longueur qui lui permet de pénétrer le plus profondément possible dans la pointe micro capillaire. Couper l’électrode du côté non encodé à la longueur appropriée.
Maintenant, passez à la préparation d’une solution de sel avec agarose. Dans un flacon contenant de l’eau dissoudre le chlorure de potassium et utiliser un agitateur magnétique pour faciliter le mélange. Après avoir enlevé l’agitateur ajouter agarose à la fiole.
Prenez le flacon au micro-ondes et chauffez-le pour faire fondre l’agarose à environ 100 degrés Celsius. Sortez-le pour vérifier visuellement que l’agarose est complètement dissoute. Une fois que l’agarose est dissoute pipette 10 microlitres dans le micro-capillaire lentement pour éviter les bulles d’air.
Il est important de pipette soigneusement la solution de sel d’agar dans la pointe micro capillaire, en particulier à des concentrations élevées d’agar. Si elles ne sont pas faites correctement bulles d’air sont facilement produites dans la pointe et bloquer le flux électrique. Après avoir retiré la pointe de la pipette pousser l’électrode en elle.
Assurez-vous que l’électrode pénètre dans la solution de sel. Lorsque l’électrode est à température ambiante, branchez-la dans une électrode de référence dans un amplificateur. Soutenez l’électrode de référence afin qu’elle puisse être abaissée dans un récipient en plastique avec un millilitre de tampon.
Ensuite, trempez l’électrode de pont de sel dans la solution. Appliquez une tension et vérifiez qu’il y a une réponse actuelle avant de continuer. Si le test est réussi, déconnecter les électrodes.
Si nécessaire, conserver l’électrode du pont salé en la trempant dans une solution de chlorure de potassium à trois molaire. Ensuite, préparez le tampon contenant la pointe en plastique. Prenez une pointe micro capillaire et identifiez un point à deux centimètres de la partie étroite.
Utilisez un fil chauffant pour plier le tube à 90 degrés à cette position. À l’aide d’un couteau tranchant, couper le tube à cinq millimètres du plié. Nettoyez la zone qui a été coupée avec de l’éthanol suivi de l’eau.
Avant de procéder, utilisez un microscope léger avec une balance pour mesurer le diamètre du trou à la pointe. Ensuite, déplacez la pipette pour être près d’un récipient de solvant et un autre de tampon. Pipette trois microlitres du solvant dans et hors de la pointe.
Ensuite, remplissez la pointe de mesure avec trois microlitres de tampon. Maintenant, récupérez le pont de sel de la solution de chlorure de potassium. Branchez la pointe de mesure avec le tampon sur l’électrode du pont salé.
Connectez l’électrode de pont de sel et l’électrode de référence à un amplificateur. À ce stade, suspendre l’électrode de pont de sel dans la solution tampon avec l’électrode de référence. Une représentation de la configuration de l’expérience est dans ce schéma.
Pendant l’expérience, la membrane se formera à la fin du tampon contenant de la pipette. Recueillir des données pour trouver la capacité de la membrane. Faites ceci en appliquant un signal triangulaire de tension alternée pour créer une réponse rectangulaire alternée de courant.
Ensuite, trouvez la conductance et la tension à courant zéro. Automatisez l’application d’une rampe de tension allant de moins 50 à 50 millivolts et enregistrez le courant. Adapter une fonction linéaire aux données.
La pente est la conductance, la x-interception est la tension à courant zéro. Une fois terminé, retirez la pointe de mesure du pont de sel. Remplissez une nouvelle pointe de mesure avec tampon, ajustez-la à différentes valeurs de pH pour configurer un gradient de protons à travers la membrane.
Rétablir l’expérimental mis en place avec une nouvelle pointe de mesure et des électrodes afin de répéter les mesures. Voici des enregistrements de tension actuels représentatifs en présence d’un gradient de pH. Et, en l’absence d’un gradient de pH.
Les lignes représentent un ajustement linéaire aux données. Le déplacement du point d’intersection x-axe pour les différentes valeurs de pH est prédit par l’équation de Nernst. Ces données représentent le déplacement du potentiel membranaire à temps pour une électrode de chlorure d’argent standard en blanc, et l’électrode de pont de sel de micro-agar en noir.
L’électrode de pont de sel d’agar était plus stable avec un décalage maximum de moins de cinq millivolts plus de 300 secondes de mesure. Dans cette parcelle du décalage potentiel en fonction du gradient de pH, les deux électrodes se comportent de façon significativement différente à mesure que le gradient de pH augmente. Le taux de rotation des protons peut être trouvé et comparé pour les deux types d’électrodes.
Voici les chiffres de rotation des protons déterminés pour la protéine de découplage mitochondrial un UCP1 mesuré par l’électrode de pont de sel par rapport à une électrode standard. Il existe également des données pour ucp3 préparé de la même façon. Les tarifs semblent plus précis avec l’électrode de pont de sel d’agar.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que l’électrode pénètre dans la solution de sel d’agar. Le pont de sel doit également plonger dans la solution tampon. Enfin, assurez-vous que la solution de sel d’agar ne contient pas de bulles d’air.
