L’imagerie CSOM de photométrie de fibre combine l’indicateur personnalisé génétiquement codé et les fibres optiques pour surveiller l’activité neuronale chez l’animal librement mobile. Ce qui est essentiel pour comprendre comment un groupe spécifique de neurones jouent dans la réalisation ou la réponse à une action ou un stimulus. Cette technique est un moyen accessible d’enregistrer à partir de régions spécifiques du cerveau qui sont définies par leur connexion ou profils génétiques, avec le contrôle intégré pour séparer le signal au bruit.
La démonstration du processeur sera, Ekaterina Martianova, une étudiante diplômée dans mon laboratoire. Commencez par desserrer toutes les vis sur le traducteur à cinq axes. Vissez le cordon de patch à l’adaptateur qui est fixé au traducteur à cinq axes.
Allumez ensuite la lumière d’excitation de 470 nanomètres à basse puissance et placez la pointe de la fibre pointant vers une glissière en plastique fluorescent automatique. Prochain enregistrement de l’appareil semi-conducteur d’oxyde de métal gratuit ou caméra CMOS en mode live. Augmentez le gain ou ajustez la table de recherchez jusqu’à ce que l’image soit visible au point focal de l’objectif.
Avancez le traducteur à cinq axes vers l’objectif en veillant à ce que la lumière de 470 nanomètres soit centrée sur la fibre à l’extrémité SMA ou FC du cordon de patch, jusqu’à ce qu’une image puisse être résolue sur la caméra. Enfin, ajustez les axes X et Y jusqu’à ce que l’image soit centrée et bien résolue. Visualisez la lumière émise par l’extrémité variole du cordon de patch, car elle devrait apparaître comme un cercle isotropique.
Commencez par allumer toutes les lumières d’excitation pour mieux visualiser les fibres. Et ajuster les gains de la caméra de telle sorte qu’aucun pixel n’est saturé, et une image claire des fibres sont présents. Ensuite, prenez une image préliminaire.
Dessinez les régions d’intérêt ou rois autour des fibres. Et gardez-les pour la mesure des valeurs moyennes d’intensité pendant les enregistrements. Pour plusieurs enregistrements de fibres, testez pour les indépendants par enregistrement en direct de toutes les fibres.
Dirigez une fibre vers une source de lumière, et appuyez avec un doigt. Observez les fluctuations du chenal. Appliquez ensuite du ruban coloré à l’extrémité des fibres pour étiqueter quel retour sur investissement correspond à quelle fibre.
Enfin, installez la zone d’enregistrement en accrochant le cordon de patch au-dessus de l’arène à l’aide de gradins, de pinces et de supports. Enfin, assurez-vous que l’animal ne sera pas limité dans le mouvement par la longueur de la fibre et peut librement se déplacer dans toute l’arène. Commencez par inspecter l’extrémité distale des fibres du cordon patch par œil, et avec un mini microscope à fibres.
Si la surface des fibres est rayée, re polir les fibres à l’aide d’un film de polissage de fibres avec du gravier fin. Nettoyez ensuite les extrémités distales du cordon de patch avec 70% d’éthanol et un applicateur à pointe de coton. Nettoyez les canules à fibres optiques à l’aide de 70 % d’éthanol et d’un applicateur à pointe de coton.
Connectez l’extrémité variole du cordon patch à la fibre implantée à l’aide d’un manchon fendu en céramique recouvert d’un tube de rétrécissement noir. Pendant la connexion, assurez-vous que la manche est serrée. Laissez l’animal récupérer pendant quelques minutes.
Ensuite, commencez à enregistrer le signal optique, et exécutez l’expérience. Lors de l’enregistrement garder un œil attentif sur la trace en direct pour assurer des enregistrements de qualité. Et surveillez les sauts dans le signal, indiquant que la manche n’est pas assez serrée.
Pour les enregistrements bicolores, ajoutez une LED de 516 nanomètres au système de photométrie pour exciter le capteur de calcium fluorescent rouge, et les miroirs et filtres dichroïques appropriés. Ajoutez ensuite un séparant d’image entre l’objectif et la caméra CMOS pour séparer les longueurs d’ondes d’émission vertes et rouges. Enfin, dessinez rois autour de toutes les fibres dans les deux couleurs, rouge et vert.
Assurez-vous d’identifier clairement chaque retour sur investissement avec la fibre et le canal correspondants. Déclenchez l’excitation simultanée avec 470 nanomètres, et 560 LED de nanomètre, et alternez-les avec une LED de 410 nanomètres. Les résultats indiquent que la fluorescence mesurée a augmenté de façon significative en même temps que l’administration de bouffées d’air pour les souris avec activation de la voie LHA-LHB.
Cependant, chez les souris exprimant la protéine fluorescente verte ou GFP, aucun changement dans le signal n’a été détecté pendant l’administration des bouffées d’air. Cette technique permet aux chercheurs d’enregistrer raisonnablement à partir de différents types de cellules dans différentes régions du cerveau. Alors qu’un animal se comporte librement.
Cela fait avancer la capacité de disséquer les fonctions de ces régions du cerveau en ce qui concerne le comportement.
