Nous remercions M. Boysen des commentaires sur le manuscrit. Ce projet a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 et MA 1278/4-1 à MPM, et Cluster d&#39;excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM est enquêteur du Pôle d&#39;excellence: CellNetworks.

Une. Préparation de tampons et de protéines des échantillons <ol><li> Préparer H 2 O tampon. Utilisation Hsp90 tampon standard (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%) en tant que H 2 O tampon. Remarque: Si l&#39;échantillon a été dialysée avant l&#39;analyse, utiliser le tampon de dialyse H 2 O tampon. Il est essentiel que le tampon D O 2 se distingue de l&#39;H 2 O dans le tampon seul isotope de l&#39;hydrogène. Tampons volatils comme NH 4 CO 3 ou NH 4-acétate ou tampons composants ne sont pas adaptés! </li><li> Préparer D 2 O tampon par lyophilisation de tampon standard Hsp90 aide d&#39;un concentrateur sous vide. Après évaporation complète du H 2 O pur ajouter D 2 O pour le tube d&#39;atteindre le volume total initial (par exemple, 1 ml de tampon avec 15% de glycerol nécessite l&#39;addition de 850 ul de D 2 O). Répétez l&#39;évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre le tampon / sel comcomposants dans D 2 O 2x. </li><li> Préparer le tampon de trempe (0,4 M de KH 2 PO 4 / H 3 PO 4, pH 2,2). Remarque: Pour améliorer l&#39;efficacité de la digestion peptique de protéines très stables 4 M de chlorhydrate de guanidine et 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE-HCl) peuvent être ajoutés. </li><li> Préparer l&#39;échantillon de contrôle à 100% (6 M de chlorhydrate de guanidine, D 2 O). Ajouter le chlorhydrate de guanidine à une aliquote Hsp90 pour atteindre une concentration finale de 6 M. complètement évaporer H 2 O à partir de l&#39;échantillon et ajouter D 2 O pour le tube d&#39;atteindre le volume total initial (par exemple, 100 ul d&#39;échantillon avec 10% de glycerol nécessitent l&#39;addition 90 ul de D 2 O). Répétez l&#39;évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre les composants tampon / sel dans D 2 O. Remarque: 20-100 pmol de l&#39;échantillon sont nécessaires pour chaque injection. Préparer échantillon assez d&#39;avoir un contrôle à 100% pour chaque jour d&#39;expériences HX-MS. </li><li> Préparer 50 pmol Hsp90 dans 5 pl de tampon norme Hsp90. Note: Un montant de 20-100 pmol de l&#39;échantillon est nécessaire pour chaque point de données brutes. Le volume de l&#39;échantillon dans la réaction est de 1 à 5 pl idéalement. Ajuster la concentration pour s&#39;adapter à ces exigences. Tout tampon peut être utilisé tant qu&#39;il ne contient pas de détergents ou des composants volatils. </li></ol> 2. Préparation de la pepsine immobilisée sur aldéhyde Perles Activé <ol><li> Dissoudre 80 mg de pepsine frais dans mM de citrate de sodium à 2 ml 50 (pH 5). </li><li> Dissolvez 20 mg de cyanoborohydrure de sodium, manipuler avec soin (très toxique!) Dans 1 ml de 2 M Na 2 SO 4 et ajouter à la solution de pepsine. </li><li> Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante tout en agitant doucement (shaker par exemple les frais généraux). </li><li> Ajouter 600 mg de billes avec des groupes aldéhyde immobilisées au mélange et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 2,2 ml de 2 M Na 2 SO4 (pH 5) en aliquotes de 100 pi toutes les 3 min plus d&#39;une heure de sel lentement la pepsine. Mélanger délicatement l&#39;échantillon entre les additions dans un agitateur vertical à température ambiante. </li><li> Incuber les perles de pepsine à 4 ° C pendant 14-16 h / pendant une nuit dans un agitateur de tête. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 1 ml d&#39;éthanolamine 1 M et une incubation à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Centrifuger les billes dans un tube Falcon de 50 ml à 500 tours par minute, jeter le surnageant et remettre en suspension les billes dans de l&#39;acide formique à 0,1%. Répétez cette étape 2x. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant et le volume d&#39;estimation de billes. Ajouter un volume équivalent d&#39;acide formique à 0,1% et la stocker à 4 ° C. </li></ol> 3. Préparation des colonnes pour Amide hydrogène-échange <ol><li> Utilisez les colonnes de garde avec un diamètre intérieur de 1 mm pour le piégeage des colonnes et de 2 mm pour les colonnes de la pepsine. </li><li> Dévissez un côté de la colonne de garde et retirer le filtre. Vissez emballage funnel sur l&#39;extrémité ouverte de la colonne. Utiliser un adaptateur 1/16 de pouce et de tubes pour fixer une seringue vide (5 ml) à la sortie de fond de la colonne. Assurez-vous de fixer le gaz étanche à la colonne de garde. </li><li> Appliquer quelques gouttes de matière de tringle de suspension au-dessus de l&#39;entonnoir. Tirer le piston de la seringue pour aspirer la suspension à travers l&#39;entonnoir dans la colonne de garde. Appliquer plus de matière de tringle de suspension sur l&#39;entonnoir et poursuivre la procédure jusqu&#39;à ce que la colonne de garde est complètement remplie de matériau de la moulure. Retirez l&#39;entonnoir et placer le filtre et la bague de filtre sur l&#39;extrémité ouverte. Vissez le bouchon de colonne sur la colonne de garde et retirer la seringue de l&#39;autre côté. Fermez les deux extrémités des colonnes de garde avec des bouchons pour éviter le dessèchement du matériau de la colonne. </li></ol> 4. Configuration du système pour l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse (HX-MS) <ol><li> Raccorder la colonne de piégeage avec le système HPLC (figure 1). Équilibrer la colonne en réglant la vitesse d&#39;écoulementUne pompe de 0,4 ml / min avec 0,1% d&#39;acide formique comme solvant. Ne branchez pas la colonne de pepsine, ni la colonne d&#39;analyse encore. </li><li> Calibrer le spectromètre de masse et connecter la sortie de l&#39;HPLC à la source du spectromètre de masse. </li></ol> 5. Détermination de la gamme dynamique de l&#39;échange <ol><li> Préparer ultrapure solvant A (acide formique à 0,1% dans l&#39;eau) et le solvant B ultrapure (acide formique à 0,1% dans de l&#39;acétonitrile); solvants mixtes préparés sont disponibles dans le commerce. Purger les pompes HPLC. Mettre en place la chromatographie et les méthodes de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande par le choix d&#39;un programme avec un gradient par étape, après une courte étape de dessalage. Pour toute la longueur Hsp90 utiliser une étape de dessalage de 1-2 min, suivie par la commutation de la vanne 6 ports de dessaler / LOAD pour éluer et un gradient échelonné de 90% de solvant A/10% de solvant B à 5% de solvant A/95% de solvant B. Avant l&#39;injection réglé la soupape d&#39;injection de charge et la vanne 6 ports pour dessaler / position de chargement. Remarque: Ne pas utiliser un pepsine ou colonne d&#39;analyse au cours de cette expérience. </li><li> Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 1-10 pi H 2 O tampon et incuber pendant 10 min à 30 ° C. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s). Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l&#39;échantillon de 200 ul dans l&#39;orifice d&#39;injection de la soupape d&#39;injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT à éluer. Répétez cette opération pour au moins trois points dans le temps. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.2 mais ajouter 2-3x plus de DIT1 à l&#39;échantillon Hsp90 avant l&#39;incubation pendant 10 min à 30 ° C. </li><li> Déterminer les masses de protéines de pleine longueur par la déconvolution des spectres dans le logiciel de spectrométrie de masse. Calculer le nombre de incorporanted deutérons en comparant le poids moléculaire de la protéine Hsp90 de longueur complète avec la masse observée après chaque passage (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s). </li><li> Tracer les deutons incorporés pour Hsp90 en absence et en présence de DIT1 (en ordonnée) en fonction du temps (axe des x). Déterminer le point de temps dans la plage dynamique où la différence entre les deux courbes est maximale. Utilisez cette valeur pour le temps d&#39;incubation dans D 2 O lors de l&#39;identification d&#39;interface et de la dynamique au niveau du peptide Hsp90-DIT1. </li></ol> 6. Détermination de gastroduodénal peptides utilisant MS / MS Spectra <ol><li> Raccorder la colonne de pepsine et de la colonne d&#39;analyse au système. </li><li> Configurer les paramètres de la chromatographie et de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande, en choisissant le type et la méthode de gradient de spectrométrie de masse. Choisissez une longue pente (par exemple plus de 90 min) pour assurer une bonne résolution chromatographique. Activer spectres MS / MS sur le spectromètre de masse. Remarque: Bonne résolutiontion sur la HPLC et une grande précision de masse ont la plus haute priorité à cette étape. </li><li> Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l&#39;échantillon de 200 ul dans l&#39;orifice d&#39;injection de la soupape d&#39;injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Remarque: Si plus d&#39;une protéine à analyser dans HX-MS (à savoir Les interfaces d&#39;interaction protéine-protéine), les peptides de chaque protéine doivent être déterminés individuellement. </li><li> Identifier des peptides peptiques de Hsp90 en recherchant une base de données (c.-à Mascot) pour les peptides résultants. Note: Il est possible d&#39;utiliser une base de données personnalisée que l&#39;objectif est de déterminer que de nombreux peptides peptiques que possible et l&#39;analyse se fait avec la protéine purifiée. Pureté échantillon have être pris en compte. </li><li> Répéter cette étape sans MS / MS et par le gradient qui sera utilisé pour l&#39;expérience de HX réelle. Pour Hsp90 et DIT1 utilisent un gradient de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% de solvant B. Remarque: Les dégradés sont normalement entre 5-15 min et hautement tributaire de la complexité de l&#39;échantillon et les spécifications du système HX. </li><li> Déterminer les temps de rétention des peptides peptiques identifiés à la section 6.4 du gradient utilisé dans 6.5 et de créer une liste comprenant 1.) Séquence peptidique 2.) L&#39;état de charge de peptide et 3.) Temps de rétention. Ceci sera utilisé pour identifier chaque peptide après des expériences de HX. Note: Soyez conscient que les peptides avec petit m / z différences, l&#39;état de charge identique et temps de rétention identique peuvent être une source d&#39;ambiguïté. </li></ol> 7. Identification des interfaces d&#39;interaction protéine-protéine <ol><li> Mettre en place le gradient et la méthode de spectrométrie de masse dans le softwar de contrôlee. Utilisez un gradient linéaire de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% B. solvant Charger une méthode de spectrométrie de masse qui est optimisé pour la détection de masses entre 300-1,500 m / z, bien que la plupart des les peptides seront en dessous de 1000 m / z. Réglez la soupape d&#39;injection en position de charge, la vanne 6 ports en CHARGEMENT / DESSALAGE position. Régler la vitesse de la pompe de chargement à 0,4 ml / min. Remarque: La longueur et le type de gradient sont échantillon dépendant et peut être optimisé. Gradients plus d&#39;améliorer la résolution de la chromatographie mais diminuent l&#39;incorporation de deutons en protéines dues à dos-échange. Les méthodes choisies doivent être les mêmes pour toutes les expériences à comparer. </li><li> Pour la référence de préparer non échangée de 20 à 100 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter 100 pi de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois injecter l&#39;échantillon dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et swdémanger la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Faites cela pour Hsp90 et DIT1 individuellement et pour le mélange de protéines. </li><li> Préparer 20 à 100 pmol de Hsp90 dans un volume de 1 à 5 pl. Ajouter température réglée D 2 O tampon pour porter le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes, pour dynamique conformationnelle voir la note). Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Pour ce faire, pour chaque protéine individuellement, afin de déterminer l&#39;incorporation de deutérium dans chaque peptide en l&#39;absence de la protéine d&#39;interaction. Remarque: Lors de l&#39;étude de la dynamique de conformationmational changements, répéter l&#39;expérience avec différents temps d&#39;incubation de Hsp90 dans D 2 O tampon. Essayez de couvrir une large échelle de temps en choisissant des temps d&#39;incubation de façon logarithmique (par exemple, 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, sec 1000, etc.) O tampon D 2 de tampon et l&#39;échantillon doit être exactement identiques, sauf pour l&#39;isotope de l&#39;hydrogène. </li><li> Préparer une quantité égale de l&#39;échantillon de contrôle à 100% (20 à 100 pmol) et ajouter D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi. Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. </li><li> Pour déterminer la surface d&#39;interaction mélanger Hsp90 avec un excès d&#39;au moins 2 fois de DIT1 de déplacer l&#39;équilibre à l&#39;état consolidé (voir la note) et incuberà la température désirée jusqu&#39;à ce que la formation du complexe est à l&#39;équilibre. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes). Ajouter deux fois rapidement et injecter dans la soupape d&#39;injection de la HPLC 100 ul de tampon de refroidissement par de la glace, une pipette de haut en bas. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Répétez cette expérience avec 20-100 pmol de DIT1 et l&#39;excès de Hsp90. Remarque: les concentrations absolues dépendent de la constante d&#39;équilibre de dissociation de l&#39;interaction. Idéalement, après dilution dans du D 2 O à la concentration de la protéine ajoutée en excès doit être d&#39;au moins 10 fois le K D (soit&gt; 85% de la protéine concentrée inférieur lié). </li><li> Analyser les données acquises avec un logiciel adapté et en utilisant les temps de rétention déterminés dans l&#39;étape 6.5 pour trouver chaque peptide dans l&#39;analyse. Calculte du centroïde de la distribution de l&#39;isotope pour la protéine non échangée (étape 7.2) et pour les expériences de HX (étape 7.3). Remarque: Bien que les modèles isotopiques de peptides échangés semblent différents de leurs homologues non échangées, à la fois les connaissances sur l&#39;état du peptide de charge et la précision de la masse élevée du spectromètre de masse permet de déterminer facilement les centres de gravité. </li><li> Comparer incorporation de deutons de protéine cible seul et avec plus de partenaire de liaison. Cela peut être fait automatiquement avec le logiciel commercial ou manuellement à l&#39;aide d&#39;un tableur. Les valeurs de l&#39;échantillon de contrôle de 100% indiquent l&#39;échange maximal pour chaque peptide et peuvent être utilisées pour déterminer la quantité de D 2 O étiquette perdue lors de l&#39;expérience à cause de l&#39;échange en arrière. </li></ol>

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	<li>Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+studied+by+cryo-electron+microscopy.">Conformational changes studied by cryo-electron microscopy.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).</li><li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li><li>Rist, W., J&#248;rgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+temperature-induced+conformational+changes+in+the+Escherichia+coli+heat+shock+transcription+factor+sigma+32+by+amide+hydrogen+exchange.">Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange.</a> The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).</li><li>Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+hydrogen+exchange+studied+by+the+fragment+separation+method.">Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method.</a> Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).</li><li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry:+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation.">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).</li><li>Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+different+proteases+working+in+acidic+conditions+to+improve+sequence+coverage+and+resolution+in+hydrogen/deuterium+exchange+of+large+proteins.">Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).</li><li>Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., J&#248;rgensen, T. J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+hydrogen+exchange+measured+at+single-residue+resolution+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+capture+dissociation+of+electrosprayed+protein+ions+for+spatially+resolved+hydrogen+exchange+measurements.">Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).</li><li>Yamada, N., Suzuki, E. -. I., Hirayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+interface+of+a+large+protein-protein+complex+using+H/D+exchange+and+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).</li><li>Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+motif+interactions+in+MAP+kinases+revealed+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).</li><li>Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-crystallin+regions+affected+by+adenosine+5'-triphosphate+identified+by+hydrogen-deuterium+exchange.">Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange.</a> Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).</li><li>Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+interactions+in+HIV-1+maturation+identified+by+hydrogen-deuterium+exchange.">Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).</li><li>Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+changes+in+viral+capsids+by+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).</li><li>Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+and+kinetic+folding+of+rabbit+muscle+triosephosphate+isomerase+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).</li><li>Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+the+GdmHCl-induced+molten+globule+state+of+creatine+kinase+monitored+by+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).</li><li>Lanman, J., Lam, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+interactions+in+HIV-1+capsid+protein+assembly+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).</li><li>Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amide+hydrogen+exchange+reveals+conformational+changes+in+hsp70+chaperones+important+for+allosteric+regulation.">Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation.</a> J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).</li><li>Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+kinetically+resolved+changes+in+the+conformational+dynamics+of+the+Hsp90+chaperone+machine.">Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine.</a> EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).</li><li>Lee, C. -. T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+regulation+of+Hsp90+by+the+co-chaperone+Sti1.">Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1.</a> EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).</li><li>Lou, X., Kirchner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteration+distribution+estimation+with+improved+sequence+coverage+for+HX/MS+experiments.">Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments.</a> Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).</li><li>Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+analysis+of+bimodal+isotope+peak+distributions+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+using+HeXicon.">Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon.</a> Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).</li><li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment.">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li><li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis.">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li><li>Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+EX1+signatures+caused+by+sample+carryover+during+HX+MS+analyses.">False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses.</a> Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).</li><li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates.">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale.">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li><li>Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+membrane+transport+protein+probed+by+h/d+exchange+and+covalent+labeling:+the+glycerol+facilitator.">Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator.</a> J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).</li><li>Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling.">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Liaison d&#39;un partenaire d&#39;interaction d&#39;une protéine entraîne inévitablement des changements dans l&#39;accessibilité au solvant sur le site de liaison. En outre, de nombreuses protéines subissent des changements conformationnels dynamiques lors de la liaison, qui touchent d&#39;autres régions que l&#39;interface de liaison réelle. HX-MS est une méthode robuste pour surveiller ces changements et est même capable de révéler des changements conformationnels de protéines sur des échelles de temps q...

Le nombre de structures cristallines des protéines et complexes de protéines a augmenté rapidement ces dernières années. Ils présentent des instantanés précieux de l&#39;organisation structurelle de ces protéines et fournissent une base pour l&#39;analyse structure-fonction. Cependant, la dynamique des protéines et les changements de conformation, qui sont essentielles pour leurs fonctions, sont rarement révélées par cristallographie aux rayons X. Cryo-microscopie électronique, d&#39;autre part, est capable de capturer des complexes de protéines et des protéines dans des conformations différentes, mais en général ne peut pas résoudre les changements conformationnels jusqu&#39;au niveau de la structure secondaire 1. Dynamique conformationnelle des protéines en solution à des détails atomiques ne peuvent être résolus par RMN, mais cette méthode reste limitée aux protéines de taille relativement petite (généralement ≤ 30 kDa) et les besoins des concentrations élevées de protéines (≥ 100 de pM), qui entrave expériences avec oligomérisation ou d&#39;agrégation des protéines sujettes 2. Une méthode quiest capable de combler entre haute résolution cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique, et qui n&#39;est pas limitée par la taille de la protéine ou de la concentration de l&#39;hydrogène est l&#39;amide-1 H / 2 H-échange (HX) en combinaison avec la spectrométrie de masse (MS). Ces dernières années, ce procédé a mis au point un outil d&#39;analyse utile pour l&#39;analyse de la dynamique des protéines, le repliement des protéines, la stabilité des protéines et des changements de conformation 3-5. La base moléculaire de cette méthode est la nature labile du squelette hydrogènes d&#39;amide dans les protéines, qui vont échanger avec des atomes de deutérium lorsque la protéine est placé dans une solution de D 2 O. L&#39;augmentation subséquente de la masse de la protéine au cours du temps est mesurée avec MS à haute résolution. En bref peptides non structurés ne HX dépend de la température, la concentration en catalyseur (OH -, H 3 O + ie pH, voir la figure 3) et des chaînes latérales d&#39;acides aminés des résidus adjacents dues à inductive, chateffets alytic et stériques. Ces effets sur la valeur intrinsèque du taux de change chimique k ch ont été élégamment quantifiée par Bai et al. 6 et un programme est disponible (avec la permission Z. Zhang), qui calcule k ch pour chaque acide aminé dans un polypeptide dépend du pH et de la température. A pH neutre, et des températures ambiantes ch k est de l&#39;ordre de 10 1 à 10 3 s -1. Dans les protéines pliées HX peut être 2-9 ordres de grandeur plus lentes principalement due à la liaison hydrogène dans la structure secondaire et à un degré moindre en raison de l&#39;accès restreint de hydratés ions OH - à l&#39;intérieur d&#39;une protéine étroitement replié. HX en protéines natives implique donc déroulement, l&#39;échange chimique partielle ou globale et repliement à l&#39;état natif selon l&#39;équation (1) et les taux de change observés k obs dépendent du taux d&#39;ouverture k op, les taux de clôture k cl et l&#39;échange chimique intrinsèque rate ch k selon l&#39;équation (2). <img alt="Équations 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg" /> Dans des conditions natives de l&#39;Etat k op est beaucoup plus petit que k ch et peut être négligée dans le dénominateur. Il existe deux régimes de change extrêmes appelés EX1 et EX2. Si la cl k est beaucoup plus petit que k ch (EX1) du taux observé est pratiquement égale à la vitesse d&#39;ouverture et de HX permet l&#39;observation immédiate du déploiement d&#39;un élément de structure. Un tel régime de change, où tout protons amide échange à la fois lors de l&#39;ouverture de l&#39;élément structurel, est facilement observable dans MS par une distribution bimodale des pics isotopiques 7. Si k cl est beaucoup plus grand que k ch (EX2) du taux observé est proportionnel à k ch lequel la constante de proportionnalité est égal aux équilibres de pliage-dépliage constante K = k u op </sub&gt; / K cl. Dans ces conditions, beaucoup d&#39;ouverture et de clôture des événements sont nécessaires avant tout échange de protons amide pour deutons, conduisant à une augmentation graduelle de la masse moyenne, tandis que la distribution isotopique reste à peu près le même. Le régime de EX2 permet la détermination de l&#39;énergie libre de dépliement Ag u et donc la stabilité d&#39;un élément de structure. Sous la condition native de l&#39;Etat du régime de EX2 est la plus courante. Augmentation du pH et l&#39;ajout d&#39;agents chaotropiques peut changer le mécanisme de change pour EX1. Par conséquent, HX-MS peut être utilisée pour explorer thermodynamique ainsi que des paramètres cinétiques de repliement des protéines et des changements conformationnels. Comme mentionné ci-dessus HX est intrinsèquement dépendante du pH et de la température et de l&#39;échange de demi-vie d&#39;un proton complètement exposé au solvant du groupe amide du squelette est comprise entre 5 à 400 msec à pH physiologique (pH 7,6) et 30 ° C, mais à 10 min&gt; 15 h avec une moyenne de&gt; 2 h à pH 2,9 et à 0 °C (sauf pour le proton de la première épine dorsale liaison amide d&#39;un polypeptide, qui échange avec une demi-vie de ca. 1-2 min). Dans ces conditions, l&#39;échange lent, il est possible de digérer l&#39;échantillon en utilisant des protéases (par exemple la pepsine) qui sont actives dans ces conditions, avec les perdre toutes les informations contenues dans les deutons incorporés. Depuis l&#39;introduction de la digestion gastro-duodénal dans des conditions échanger lents, non seulement la cinétique de HX ensemble de protéines de pleine longueur peuvent être analysés mais HX peuvent être localisés à des régions spécifiques 8,9. La résolution spatiale est limitée à la taille des fragments peptiques générés, ce qui est en général comprise entre 10-30 résidus. Cependant, les fragments chevauchants créés en raison de la nature non spécifique de clivage par la pepsine pourraient conduire à une augmentation de la résolution spatiale. En outre, plusieurs autres proteases se sont révélés être actifs dans des conditions de trempe, cependant, beaucoup moins efficaces que la pepsine 10. En outre augsoi de la résolution spatiale peut être atteint par la fragmentation de peptides en phase de gaz par des méthodes qui ont préservé le modèle de deutération comme la capture d&#39;électrons dissociation (DPE), transfert d&#39;électrons dissociation (ETD) et infrarouge dissociation multiphotonique (IRMPD) 11-13. Ces techniques empêchent la perte de résolution spatiale due à la migration intramoléculaire de proton (&quot;brouillage&quot;), qui est observée par dissociation induite par collision (CID) de la technique de fragmentation le plus couramment utilisé. Cependant, ces méthodes nécessitent l&#39;optimisation pour chaque peptide individuel et est donc encore assez difficile. HX-MS a été utilisé pour analyser les interactions protéine-ligand et la protéine-protéine, y compris l&#39;assemblage de la capside virale 14-17. Protéines de repliage et dépliage ainsi que la température des changements conformationnels induits ont été étudiés 7,18,19. Phosphorylation et unique de conformation liée à la mutation d&#39;acides aminés et modifie 16,20 nucleotchangements ide-induits ont été analysés 21,22. Par conséquent, cette méthode semble parfaitement adapté pour analyser l&#39;assemblage et la dynamique des machines moléculaires. Un candidat intéressant, dont le mécanisme est d&#39;un grand intérêt général, est le complexe chaperon Hsp90.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maXis QTOF</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoAcquity UPLC</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu 10AD-VP</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-port Valve EPC6W with microelectric actuator</td>
			<td>Valco</td>
			<td>#EPC6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection valve (manual)</td>
			<td>Rheodyne</td>
			<td>#7725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros AL20 media</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-6029-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros R2</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-1118-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6887</td>
			<td>use fresh pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (1 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (2 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC BEH C8 Column</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td>#186002876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5355000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (various diameters)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fittings</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#PK-110 with PK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry

Tous les processus cellulaires dépendent de la fonctionnalité des protéines. Bien que la fonctionnalité d&#39;une protéine donnée est la conséquence directe de la séquence d&#39;acides aminés unique, il ne se matérialise que par le repliement de la chaîne polypeptidique en une seule disposition tridimensionnelle définie ou plus couramment en un ensemble de conformations interconversion. Enquête sur le lien entre la conformation de la protéine et sa fonction est donc essentiel pour une compréhension complète de la façon dont les protéines sont en mesure de remplir leur grande variété de tâches. Une possibilité d&#39;étudier des changements de conformation d&#39;une protéine subit tout en progressant au travers de son cycle de fonctionnement est de l&#39;hydrogène H-1/2 H-échange, en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HX-MS). HX-MS est une méthode souple et robuste qui ajoute une nouvelle dimension à l&#39;information structurale obtenue par cristallographie par exemple. Il est utilisé pour étudier le repliement des protéines et le déploiement, la liaison de petit molecule ligands, les interactions protéine-protéine, des changements conformationnels liés à la catalyse enzymatique, et allostery. En outre, HX-MS est souvent utilisé lorsque la quantité de protéine est très limitée ou la cristallisation de la protéine n&#39;est pas réalisable. Ici, nous fournissons un protocole général pour étudier la dynamique des protéines avec HX-MS et décrivons comme un exemple pour révéler l&#39;interface d&#39;interaction des deux protéines dans un complexe.

Hsp90 est un chaperon moléculaire dans la levure et de la famille de Hsp90 chaperone. En passant par un cycle du complexe ATPase il assiste fin des étapes de pliage d&#39;un grand nombre de protéines clients. Pliage efficace nécessite un transfert de clients de Hsp70 et de l&#39;interaction de la Sti1/Hop co-chaperon. STI1 se lie directement à Hsp90 et facilite la liaison par inhibition de l&#39;activité d&#39;ATPase de la protéine Hsp90 client. Interaction de Hsp90 avec DIT1 a récemment été étudiée en utili...

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l&#39;échange d&#39;hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

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18.3K vues.  University of Heidelberg.  conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques. 

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Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analyse de l’haleine en temps réel en utilisant l’ionisation secondaire SPECTROMETRIE couplée à la spectrométrie de masse haute résolution

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

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Chimie

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthèse et analyse de spectrométrie de masse des Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosion par imagerie à l’interface métal-peinture utilisant la spectrométrie de masse ionique secondaire à temps de vol

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Reconstruction 3D du profil de profondeur des impuretés ségréguées à l’aide de la spectrométrie de masse d’ions secondaires

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...