Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathologie du cancer, en quantifiant les protéines des biomarqueurs à partir de matériel de biopsie régulièrement traité. Les principaux avantages de cette technique par rapport à l’immunohistochimie conventionnelle, sont qu’elle est objective, a une large gamme dynamique, et permet la quantification des protéines dans des types de cellules spécifiques. La présence ou l’absence de certaines protéines dites biomarqueurs, ou plus particulièrement, l’abondance relative de ces protéines dans les échantillons de biopsie du cancer peuvent être très utiles pour faire un diagnostic pathologique spécifique de certains types de cancers.
Mais il peut également être utile pour prédire la réponse aux traitements contre le cancer, c’est pourquoi cette technique est pertinente à la fois pour le diagnostic et le traitement des patients atteints de cancer. Ce protocole est principalement sur la façon d’utiliser la quantification des protéines dans les lignées cellulaires immortalisées pour valider la nature quantitative de l’analyse basée sur l’immunofluorescence. Mais il est important de noter que l’immunofluorescence peut facilement être incorporée dans une approche multiplexée, et appliquée aux échantillons primaires de biopsie.
Lee Boudreau, technicien, et Shakeel Virk, directeur des opérations, assisteront et démontreront cette procédure. Tous deux du Laboratoire de pathologie moléculaire de la Reine. Pour commencer, centrifugez les cellules précédemment récoltées dans un tube conique de 50 millilitres à 225 Gs pendant cinq minutes.
Décanter le supernatant, et resuspendre la pastille cellulaire en 10 millilitres de PBS. Puis, centrifugeuse les cellules réutilisées à 225 Gs pendant cinq minutes. Suspendre la pastille cellulaire avec 10 millilitres de 10%NBF.
Puis incuber les cellules à température ambiante sur un rocker à 24 RPM pendant la nuit. Après avoir fixé les cellules, centrifuger les cellules à 225 Gs pendant cinq minutes. Retirez ensuite le supernatant et réutilisez les cellules en 500 microlitres de PBS.
Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et pelleter les cellules par centrifugation. Ensuite, aspirez le surnatant. Ajouter environ 500 microlitres de solution 1% agarose à chaque tube contenant des cellules.
Ensuite, pipette le mélange de haut en bas pour mélanger. Après que la solution cellulaire agarose durcit, ajouter un millilitre de 10%NBF aux tubes. Plus tard, retirez la FBN des échantillons.
Utilisez une lame de rasoir pour enlever la fiche cellulaire et placez la fiche dans une cassette de tissu en plastique. Traiter les échantillons pendant la nuit avec un processeur de tissu automatisé. Puis, intégrer les échantillons dans la cire de paraffine, en utilisant des méthodes d’histologie standard.
À l’aide d’un instrument de tableau de tissus, récolter les noyaux de 6 millimètres du bloc de paraffine et les insérer dans un bloc de paraffine vide. Après cela, utilisez une microtome pour préparer deux sections histologiques de la lignée cellulaire nouvellement créée, TMA. Montez ensuite les sections sur une diapositive d’histologie, et déparaffinez-les.
Tout d’abord, charger les deux glissières de la ligne cellulaire TMA dans un système automatisé de coloration. Tachez un côté avec la dilution primaire optimale d’anticorps, laissant l’autre comme glissière négative de commande. Sur les deux diapositives, appliquez un contre-tache nucléaire et un anticorps secondaire.
Après le processus de coloration, ajouter les reagents d’amplification du signal tyramide. Après cela, numérisez les diapositives immunotachées à l’aide des longueurs d’onde d’excitation et de détection appropriées pour les fluorophores qui ont été utilisés. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour identifier le compartiment cellulaire d’intérêt, qu’il s’agisse d’un noyau ou d’un cytoplasme, et quantifier l’intensité moyenne de fluorescence, ou IMF, pour chaque ligne.
Pour déterminer quelle lignée cellulaire a la plus grande abondance de la protéine cible, aliquot précieusement préparé cellules lysate dans les tubes de microcentrifugeuse. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres de tampon laïc de 6x, et suffisamment de tampon de lyse RIPA pour porter le volume total à 15 microlitres. Ensuite, chargez un gel de page SDS, avec une échelle protéique, et les échantillons précédemment préparés.
Après cela, chargez la tampon laemly dans les puits vides. Faire fonctionner le gel jusqu’à ce que le colorant bleu atteigne le fond de la plaque. Après avoir effectué un transfert de protéines semi-sec, utilisez une lame de rasoir pour couper la membrane horizontalement pour séparer la protéine d’intérêt de la protéine de contrôle.
Effectuer des incubations de blocage et d’anticorps selon les instructions des fabricants. Placez ensuite les bandes membranaires dans un sac en plastique transparent. Utilisez une pipette P1000 pour couvrir les membranes avec le mélange ECL.
Ensuite, sceller le sac, et incuber les membranes à température ambiante dans l’obscurité pendant une à deux minutes. Ensuite, placez le sac en plastique contenant les membranes dans une plate-forme d’imagerie numérique. Utilisez la chimioluminescence et la détection des marqueurs colorimétriques pour capturer diverses expositions de la membrane.
À l’aide d’un logiciel d’analyse d’image ou d’une observation visuelle, déterminez quelle lignée cellulaire exprime la protéine la plus cible. Après immunoblotting une dilution périodique de cette ligne cellulaire, ouvrez les images d’exposition à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image. Utilisez l’outil sélections rectangulaires pour sélectionner la première voie du gel.
Ensuite, allez analyser, gels, et sélectionnez la première voie. Répétez ce processus en déplaçant l’outil de sélection rectangulaire vers la voie suivante, et allez analyser, gels, et sélectionnez la voie suivante. Ensuite, allez analyser, gels, et les voies de parcelle.
Utilisez l’outil en ligne droite pour tracer des lignes à travers les bases de chaque pic, pour supprimer le bruit de fond. Utilisez ensuite l’outil baguette magique pour sélectionner chaque pic et obtenir l’intensité de la bande de chaque pic à partir de la fenêtre de résultats. Créez un scatterplot d’intensité de bande par rapport à la quantité totale de protéines chargées pour chaque anticorps primaire en utilisant la sortie densitométrie.
Ensuite, utilisez une ligne de meilleur ajustement et d’observation visuelle pour déterminer l’emplacement de la plage dynamique linéaire de chaque anticorps. Sélectionnez une concentration protéique qui donne une intensité de bande dans la plage linéaire, et effectuez un immunoblot de toutes les lignées cellulaires lysates avec cette concentration de protéines, comme démontré précédemment. Ensuite, effectuez la densitométrie sur les balayages numériques, en sélectionnant les expositions qui produisent des signaux dans les plages linéaires précédemment identifiées pour chaque anticorps.
Après cela, calculez le rapport entre l’intensité de la bande protéique cible et l’intensité de la bande de contrôle de chargement pour chaque lignée cellulaire. Enfin, utilisez un logiciel statistique pour effectuer un test de corrélation Pearson entre les valeurs obtenues à partir de l’analyse d’image de la coloration IF, et celles obtenues à partir de l’immunoblotting. Ce protocole a été utilisé pour confirmer la capacité de la SI à déterminer la quantité relative de la protéine antipoptotique Bcl-2.
Des dilutions variables de l’anticorps primaire ont été examinées sur le tissu humain d’amygdale avec un stainer d’immunohistologie. Pour cette expérience, une dilution d’un à 50 a été déterminée comme la dilution optimale qui a donné un signal fort avec peu de bruit de fond. Cette dilution a été utilisée pour tacher la lignée cellulaire TMA par immunofluorescence, et l’analyse d’image a été utilisée pour quantifier le signal cytoplasmique Cy5 attribué à Bcl-2.
Basé sur l’immunoblot pour toutes les lignées cellulaires testées, Granta-519 avait la plus grande abondance de Bcl-2. Un immunoblot de la dilution périodique du lysate Granta-519 a ensuite été utilisé pour trouver la plage dynamique linéaire de Bcl-2, et contrôler la protéine GAPDH. La plage dynamique de Bcl-2 dans cet essai 100 rangeait d’une intensité de bande de près de 0 à 7500 unités.
La plage dynamique de GAPDH 1000 à 6500 unités. L’immunoblot a été répété avec des expositions dans cette gamme linéaire. Et le rapport de Bcl-2 à GAPDH a été calculé pour chaque lignée cellulaire.
Un test de corrélation Pearson a démontré que les ratios d’intensité de l’immunoblotting étaient fortement et positivement corrélés avec les lectures d’intensité de la SI quantitative. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’exposer la membrane finale pour plusieurs points de temps, Afin de trouver l’exposition optimale où toutes les bandes sont dans leurs gammes linéaires respectives. Après validation de la nature quantitative du protocole IF, il peut être modifié pour le multiplex IF, dans des échantillons de tissus traités régulièrement afin de répondre à des questions cliniques telles que l’endroit où une protéine cible est exprimée.
