Bu yöntem, rutin olarak işlenmiş biyopsi materyalinden biyomarker proteinleri ölçerek kanser patolojisi alanındaki temel soruların yanıtlandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin konvansiyonel immünohistokimyaile ilgili başlıca avantajları, objektif olması, geniş bir dinamik menzile sahip olması ve belirli hücre tiplerinde proteinlerin sayısallaştırılmasına izin vermeleridir. Bazı sözde biyomarker proteinlerin varlığı veya yokluğu, ya da daha spesifik olarak, kanser biyopsisi örneklerinde bu proteinlerin göreceli bolluğu kanserlerin belirli türde belirli bir patolojik tanı yapımında çok yararlı olabilir.
Ama aynı zamanda kanser tedavileri yanıt tahmin yararlı olabilir, bu yüzden bu teknik kanser hastalarının tanı ve tedavisi hem de ilgilidir. Bu protokol esas olarak, immünoffloresan dayalı testin nicel doğasını doğrulamak için ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında protein niceleminin nasıl kullanılacağı ile ilgilidir. Ancak immünororesksanın çok katlı bir yaklaşıma kolayca dahil edilebildiği ve primer biyopsi örneklerine uygulanabildiği unutulmamalıdır.
Bu prosedüre yardımcı olmak ve göstermek için teknisyen Lee Boudreau ve operasyon direktörü Shakeel Virk olacaktır. İkisi de Queen's Moleküler Patoloji Laboratuvarı'ndan. Başlamak için, beş dakika için 225 Gs 50 mililitrekonik tüp içinde daha önce hasat hücreleri santrifüj.
Süpernatant'ı dekantlet ve hücre peletini 10 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, 225 Gs'de yeniden askıya alınan hücreleri beş dakika santrifüj edin. 10 mililitre %10 NBF ile hücre peletini askıya alın.
Sonra bir gecede 24 RİB'de bir rocker oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya yatırın. Hücreleri onardıktan sonra, hücreleri 225 Gs'de beş dakika santrifüj edin. Sonra supernatant çıkarın ve PBS 500 mikrolitre hücreleri resuspend.
Hücreleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj yoluyla hücreleri pelet. Sonra, supernatant aspire. Hücreleri içeren her tüpe yaklaşık 500 mikrolitre %1 agarose çözeltisi ekleyin.
Sonra, pipet karışımı yukarı ve aşağı karıştırmak için. Agarose hücre çözeltisi sertleştikten sonra tüplere bir mililitre %10 NBF ekleyin. Daha sonra, nbf'yi örneklerden çıkarın.
Hücre fişini çıkarmak için bir jilet kullanın ve fişi plastik bir doku kasetine yerleştirin. Örnekleri bir gecede otomatik doku işlemcisi ile işleyin. Daha sonra, standart histoloji yöntemleri kullanarak, parafin balmumu örnekleri gömmek.
Bir doku arrayer alet kullanarak, parafin bloğundan 6 milimetrelik çekirdekleri hasat edin ve boş bir parafin bloğuna yerleştirin. Bundan sonra, yeni oluşturulan hücre hattı, TMA iki histolojik bölümleri hazırlamak için bir mikrotom kullanın. Daha sonra bölümleri bir histoloji slaytına monte edin ve onları ayırın.
İlk olarak, hücre hattı TMA'nın iki slaytını otomatik bir boyama sistemine yükleyin. En iyi primer antikor seyreltme ile bir tarafı leke, negatif bir kontrol slayt olarak diğer bırakarak. Her iki slayt için, bir nükleer karşı leke uygulamak, ve ikincil antikor.
Boyama işleminden sonra, tiramid sinyal amplifikasyon reaktifleri ekleyin. Bundan sonra, kullanılan floroforlar için uygun uyarma ve algılama dalga boylarını kullanarak immünolekeli slaytları tarar. İster çekirdek ister sitoplazma olsun, hücresel ilgi bölmesini belirlemek ve her satır için ortalama floresan yoğunluğunu veya MFI'yi ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın.
Hangi hücre hattının hedef proteinin en büyük bolluğuna sahip olduğunu belirlemek için, aliquot değerli hazırlanmış hücre lysate mikrosantrifüj tüpler içine. Daha sonra 6x laemly tampon 2,5 mikrolitre ekleyin ve yeterli RIPA lysis tampon 15 mikrolitre toplam hacmi getirmek için. Ardından, bir Protein merdiveni ve önceden hazırlanmış örnekleri içeren bir SDS sayfa jeli yükleyin.
Bundan sonra, boş kuyulara laemly tampon yükleyin. Mavi boya tabağın altına ulaşana kadar jel çalıştırın. Yarı kuru protein transferini yaptıktan sonra, kontrol proteininden ilgi proteinini ayırmak için membranı yatay olarak kesmek için jilet kullanın.
Üreticilerin talimatlarına göre engelleme ve antikor kuluçkaları gerçekleştirin. Sonra membran şeritler imal bir plastik torbaya yerleştirin. ECL karışımı ile membranları kapsayacak şekilde p1000 pipet kullanın.
Sonra çanta mühür ve 1-2 dakika karanlıkta oda sıcaklığında membranlar kuluçka. Ardından, membranları içeren plastik torbayı dijital görüntüleme platformuna yerleştirin. Membranın çeşitli pozlamalarını yakalamak için kemilüminesans ve kolorimetrik marker algılamasını kullanın.
Görüntü analizi yazılımı veya görsel gözlem kullanarak, hangi hücre hattının en hedef proteinifade belirler. Bu hücre hattının seri seyreltme immunoblotting sonra, görüntü analiz yazılımı kullanarak pozlama görüntüleri açın. Jelin ilk şeridini seçmek için dikdörtgen seçim aracını kullanın.
Sonra analiz etmek için gidin, jeller, ve ilk şerit seçin. Dikdörtgen seçim aracını bir sonraki şeride taşıyarak bu işlemi tekrarlayın ve analiz e, jelleri ve sonraki şeridi seçin. Sonra, analiz etmek için gidin, jeller, ve şerit çizmek.
Arka plan gürültüsünü gidermek için her tepenin tabanlarına çizgiler çizmek için düz çizgi aracını kullanın. Ardından her tepe noktasını seçmek için değnek aracını kullanın ve sonuçlar penceresinden her tepenin bant yoğunluğunu elde edin. Densitometri çıktısını kullanarak her birincil antikor için yüklenen toplam protein miktarına karşılık bant yoğunluğunun bir dağılım grafiği oluşturun.
Daha sonra, her antikor lineer dinamik aralığının konumunu belirlemek için en iyi uyum ve görsel gözlem bir çizgi kullanın. Doğrusal aralıkta bir bant yoğunluğu veren bir protein konsantrasyonu seçin ve daha önce gösterildiği gibi, bu protein konsantrasyonu ile tüm hücre hattı lysates bir immünoblot gerçekleştirin. Ardından, her antikor için önceden tanımlanmış doğrusal aralıklarda sinyal veren pozlamaları seçerek dijital taramalarda densitometri gerçekleştirin.
Bundan sonra, her hücre hattı için kontrol bandı yoğunluğu yükleme hedef protein bant yoğunluğu oranını hesaplamak. Son olarak, IF boyama görüntü analizinden elde edilen değerler ile immünoblotlamadan elde edilen değerler arasında Pearson korelasyon testi yapmak için istatistiksel yazılım kullanın. Bu protokol, IF'nin anti-apoptotik protein Bcl-2'nin göreli miktarını belirleme yeteneğini doğrulamak için kullanılmıştır.
Primer antikorların farklı seyreltmeleri immünohistoloji lekesi ile insan bademcik dokusu üzerinde test edildi. Bu deney için, bir ila 50 seyreltme az arka plan gürültüsü ile güçlü bir sinyal verdi optimal seyreltme olarak belirlenmiştir. Bu seyreltme immünororesans ile tma hücre hattı leke için kullanılan ve görüntü analizi Bcl-2 atfedilen sitoplazmik Cy5 sinyali ölçmek için kullanılmıştır.
Tüm test edilen hücre hatları için immünoblot dayanarak, Granta-519 Bcl-2 en büyük bolluk vardı. Daha sonra Bcl-2'nin lineer dinamik aralığını bulmak ve GAPDH proteinini kontrol etmek için Granta-519 lysate seri seyreltme immünoblotu kullanıldı. Bu teşpteki Bcl-2'nin dinamik aralığı yaklaşık 0 bant yoğunluğundan 7500 üniteye kadar değişmekteydi.
GAPDH'nin dinamik aralığı 3000 ile 6500 arasında değişmektedir. İmmünoblot bu doğrusal aralıkta maruz kalma ile tekrarlandı. Ve Her hücre hattı için Bcl-2'nin GAPDH'ye oranı hesaplandı.
Pearson korelasyon testi, immünolotlamanın yoğunluk oranlarının kantitatif IF'den gelen yoğunluk okumaları ile güçlü ve pozitif korelasyon olduğunu göstermiştir. Bu yordamı çalışırken, tüm bantların kendi doğrusal aralıkları içinde olduğu en uygun pozlamayı bulmak için, son membranı birden çok zaman puanı için ortaya çıkarmak için hatırlaman önemlidir. IF protokolünün nicel yapısı doğruladıktan sonra, hedef proteinin ifade edildiği yer gibi klinik soruları yanıtlamak için rutin olarak işlenmiş doku örneklerinde multipleks IF için değiştirilebilir.
