This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. Culture cellulaire <ol><li> Utilisez télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) cellules de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine immortalisées (hTERT-RPE1; appelle ici RPE1). REMARQUE: les cellules sont des cellules humaines RPE1 quasi-diploïdes, non transformées qui sont couramment utilisés pour étudier ensemble centriole et ciliogenèse. Ces cellules suivent un cycle de duplication normale centriole coordonné avec un cycle cellulaire régulée. </li><li> Passage d&#39;une boîte de 100 mm de culture cellulaire quasi-confluente de cellules RPE1 à 1: 5 dilution de la culture d&#39;origine dans une boîte fraîche de 100 mm contenant 10 ml de DME / F-12 (1: 1) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (milieu complet est désignée sous le DME / F-12). Cultiver les cellules à 37 ° C en présence de 5% CO 2. <ol><li> Incuber 12 mm lamelles de verre rondes dans 50 ml de HCl 1 N dans un bécher de verre couverte, O / N sans agitation, à 60 ° C dans un bain-marie ou incubateur. </li><li> After jeter la solution acide, laver les lamelles trois fois dans 100 ml d&#39;eau distillée par incubation pendant 15 min en agitant de temps. Répéter le lavage de manière similaire dans 70% d&#39;éthanol et 95% d&#39;éthanol. </li><li> Sécher les lamelles couvre-objet en les étalant individuellement sur un papier buvard laboratoire dans une enceinte de sécurité biologique, suivi par une stérilisation avec un rayonnement UV pendant 60 min. </li></ol></li><li> 4.2 Placer les lamelles sec dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Diluer la solution de fibronectine ou de la fibronectine comme polymère d&#39;ingénierie (concentration stock de 1 mg / ml) jusqu&#39;à une concentration de 25 ug / ml dans une culture cellulaire PBS. <ol><li> Placez 80-100 ul de la solution diluée sur chaque lamelle et incuber pendant 60 min à enduire le côté haut de la lamelle. Laver les lamelles trois fois en utilisant du PBS avant d&#39;ajouter un milieu complet. </li></ol></li></ol> 2. la croissance de cellules et le traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome <ol><li> Passage 2 x 10 5 croître de manière asynchroneING RPE1 cellules dans chaque boîte de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet et cultiver les cellules dans 2 ml de milieu complet. Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures avec un milieu complet frais préchauffé. <ol><li> Pour analyser l&#39;effet de l&#39;inhibition du protéasome au niveau centrosomale de la protéine de test (ici VDAC3 ou γ-tubuline), poussent les cellules dans deux boîtes de 35 mm pour 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet et ajouter soit MG115 ou le DMSO en tant que solvant témoin à une concentration finale de 5 uM ou 0,05%, respectivement. Dans le même temps, ajouter BrdU dans les cellules à une concentration finale de 40 uM et on incube les cellules pendant 4 heures. </li><li> Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits. Ajouter 500 ul de methanol refroidi dans chaque puits et incuber la plaque à 20 ° C pendant 10 min pour fixer les cellules sur des lamelles couvre-objet. Laver immédiatement les lamelles trois fois avec 500 pi de tampon de lavage (1x PBS contenant 0,5 mM MgCl 2 et 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Récolter les résiduellecellules de la boîte de 35 mm et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min. Utiliser le culot de cellules à analyser la protéine totale par buvardage de Western (étape 6). </li></ol> 3. BrdU Pulse et Chase essai pour analyser les niveaux de protéines dans les différentes phases du cycle cellulaire <ol><li> Pour analyser la variation du niveau d&#39;une protéine (ici VDAC3, SAS6 ou Cep135) à centrosomes à différentes phases du cycle cellulaire, cultiver les cellules dans deux boîtes de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet pendant 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet contenant 40 uM de BrdU et incuber les cellules pendant 4 heures dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> D&#39;un plat, transférer les lamelles à une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à l&#39;aide de méthanol glacé comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. </li><li> Après l&#39;impulsion de BrdU 4 heures, retirer le milieu contenant BrdU, laver les cellules une fois avec du PBS et une fois avec du milieu complet, ajouter du milieu frais, puis les cellules croître en l&#39;absence de BrdU pendant divers temps (typiquement un autre 4 hpour les cellules RPE1) avant de fixer les cellules comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. NOTE: Pour les cellules RPE1, la majorité des cellules positives à la BrdU sont à la fin de S ou G2 phase après une poursuite de 4 heures. Cela doit être déterminé de façon indépendante pour chaque type de cellule. </li></ol> 4. Immunocoloration <ol><li> Incuber les cellules fixées sur des lamelles dans 200 ul de tampon de blocage (2% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS 1x) pendant 30 min. <ol><li> Incuber les cellules avec un mélange d&#39;anticorps primaires (typiquement chez le lapin a soulevé une et l&#39;autre soulevée dans une souris) dilué dans du tampon de blocage O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Pour faire une chambre humidifiée, mettre une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d&#39;un mille ul boîte de pointe de la pipette vide. Déposer une bande de Parafilm sur la surface de crémaillère, et repérer une gouttelette (15 à 20 pi) de la solution d&#39;anticorps sur le Parafilm pour chaque lamelle à incuber. Inverser une lamelle couvre-objet sur une gouttelette de solution d&#39;anticorps (de sorte que les cellules sont immergées) et à proximitéle couvercle de la boîte de pointe. </li><li> Inversez lamelles encore et les retourner à la boîte de 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet, puis les incuber en mélange 150 ul de l&#39;anticorps secondaire (ici colorant anti-lapin conjugué fluorescent vert-rouge et un colorant fluorescent conjugué anti-souris dilué dans du tampon de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lamelles trois fois. NOTE: Les anticorps secondaires conjugués fluorophores sont sensibles à la lumière. Protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Préparation pour la coloration anti-BrdU en fixant les cellules colorées RPE1 de nouveau avec 500 ul de methanol refroidi à -20 ° C pendant 10 min, comme décrit dans l&#39;étape 2.1.2. Laver les lamelles trois fois. REMARQUE: Cette fixation fixe le primaire et le secondaire marquage de l&#39;anticorps de la protéine (s) d&#39;intérêt au cours du processus d&#39;hydrolyse acide dans l&#39;étape suivante. <ol><li> Incuber les cellules dans 200 ul de HCl 2 N pendant 30 minutes à température ambiante. Neutraliser avec 300 pi de 1 M Tris-Cl, pH 8 uneD laver les cellules trois fois avec le tampon de lavage. </li><li> Bloquer de nouveau les cellules en utilisant 200 ul de tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps de rat anti-BrdU (dilué dans du tampon de blocage) pendant 45 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Retourner les lamelles de retour à l&#39;antenne de 24 puits, lavez-les et puis incuber avec un colorant bleu anticorps secondaire fluorescent conjugué anti-rat (dilué dans 150 pi de tampon de blocage dans un plat de 24 puits pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver les lamelles trois fois. Repérer une goutte (environ 3-6 pi) d&#39;une solution de montage contenant antifade réactif sur une lame de microscope en verre. Inverser une lamelle couvre-objet, avec la cellule du côté orienté vers le bas, sur la solution de montage. Essuyez l&#39;excès de liquide en appuyant doucement la lamelle contre la diapositive en utilisant des tissus de nettoyage doux. Appliquer le vernis à ongles transparent le long du bord de la lamelle pour la sceller sur la lame de microscope. </li></ol> 5. immunofluorescence image Acquisition et Analyse <ol><li> Utilisez un objectif à immersion d&#39;huile plan 100X Apo (avec une ouverture numérique de 1,4) pour acquérir les images de cellules RPE1 BrdU-positifs à la température ambiante. <ol><li> Placer une lame sur le microscope (voir équipement) attaché avec une caméra capable de l&#39;imagerie numérique. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps d&#39;exposition approprié (typiquement entre 300-1000 ms) en examinant manuellement tous les échantillons d&#39;une expérience. Avant l&#39;acquisition des images d&#39;une cellule, déterminer manuellement la partie supérieure appropriée et fond plan focal le long de l&#39;axe Z (en général 0,2 um taille de pas). Acquérir des images de différents échantillons qui sont sur des lamelles séparées en utilisant le temps d&#39;exposition identique pour différents fluorophores le long de l&#39;axe Z en utilisant un logiciel d&#39;imagerie par microscopie numérique. </li></ol></li><li> Effectuer déconvolution (dans ces cas en utilisant l&#39;algorithme Pas de voisin) de toutes les piles d&#39;images acquises le long de l&#39;axe-Z. <ol><li> Obtenir la projection totale de l&#39;intensité de chaque pile d&#39;images le longl&#39;axe-Z. </li></ol></li><li> Dans les cellules où centrosomes sont proches (distance entre deux centrosomes est inférieure à 2 um), dessiner un petit carré (généralement 20 à 30 pixels par côté) autour des deux centrosomes et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Dessinez un carré plus grand (en général de 24 à 35 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée de la grande place. </li><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte (S désigne petite boîte et L désigne grande boîte). </li><li> Analyser le fond corrigé intensité de fluorescence de chaque fluorophore en utilisant la formule décrite par Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x S A / (A L - A S)]. </li><li> Obtenir l&#39;intensité de fluorescence normalisée de la protéine d&#39;intérêt (ici ou VDAC3 SAS6) en calculant le rapport de l&#39;intensité de fluorescence d&#39;arrière-plan corrigé de ses fluorophore à celle du fluorophore utilisé pour le standard interne choisi (ici γ-tubuline, ou SAS6 Cep135). </li></ol></li><li> Dans le cas de l&#39;analyse de cellules où centrosomes sont bien séparées (distance entre deux centrosomes est supérieure à 2 um), analyser séparément chaque centrosome en traçant deux ensembles distincts de boîtes. Dessinez un petit carré (généralement 15 à 25 pixels par côté) autour de chaque centrosome et marquer la zone sélectionnée. Dessinez un carré plus grand (20 à 30 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte, et de calculer les intensités de fluorescence corrigée fond de chaque fluorophore, séparément pour chaque centrosome, comme décrit à l&#39;étape 5.3.3. </li><li> Combiner les intensités de fluorescence de fond corrigé de chaque protéine à partir des deux centrosomes pour obtenir le niveau centrosomale totale de cette protéine dans cette cellule. </li><li> Obtenir leintensité normalisée pour la protéine d&#39;intérêt en calculant le rapport de son intensité totale centrosomale à l&#39;intensité centrosomale totale de l&#39;étalon interne. </li></ol></li><li> Analyser au moins 15 à 25 cellules pour chaque condition expérimentale et tracer le graphique dans une feuille de calcul. </li></ol> 6. Analyse de la protéine totale Utilisant Western Blot <ol><li> Resuspendre les cellules dans radioimmunoprecipitation dosage (RIPA) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 1%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) et incuber pendant 10 min sur de la glace à lyser les cellules. <ol><li> Centrifuger le mélange à 10 000 xg pendant 10 minutes, séparer le lysat provenant de la fraction de culot et de mesurer la concentration totale en protéines de chaque lysat en utilisant un acide bicinchoninique (BCA) trousse de dosage. </li></ol></li><li> Mélanger 40 pg de lysat avec SDS-PAGE 4x tampon de chargement (50 mM de Tris-Cl, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glycerol, 100 mM de dithiothréitol, 0,1% Bromophenol bleu). <ol><li> Faire bouillir les échantillons pendant 10 min et exécuter les échantillons sur un 12,5% de dénaturation SDS-PAGE à une tension constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transférer les protéines séparées sur SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose en utilisant la technique du Western blot (à une tension constante de 90 V pendant 1 heure à froid). <ol><li> Bloquer la membrane avec 3% de lait écrémé dans du PBS 1x, puis incuber la membrane avec des solutions d&#39;anticorps primaire dilué (dans ce cas de lapin anti-VDAC3, lapin anti-γ-tubuline et de souris anti-α-tubuline) pour une heure à température ambiante. </li><li> Après avoir lavé la membrane trois fois (chaque 5 minutes d&#39;incubation sous agitation) à l&#39;aide du tampon PBS-T (PBS 1x et 0,2% de Tween-20), incuber la membrane dans un mélange de proche infrarouge (IR) colorant fluorescent conjugué anti-lapin et Anticorps de colorant fluorescent IR anti-souris conjuguée secondaires (dilué dans du PBS-T) pendant 1 heure. </li><li> Laver la membrane trois fois, puis balayer la membrane d&#39;analyser les bandes en utilisant un f infrarougeSystème d&#39;imagerie par luorescence approprié pour la détection par immunotransfert. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body.">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li><li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+centriole.">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li><li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle.">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li><li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry.">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li><li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1:+defensible+or+dispensable.">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9 (2011).</li><li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components.">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976 (2009).</li><li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling.">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li><li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP+proteins:+the+knights+of+centrosome+dynasty.">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase.">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li><li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods.">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li><li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways.">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li><li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome.">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li><li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes.">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li><li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation.">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li><li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle.">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li><li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells.">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li><li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes.">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li><li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication.">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li><li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program.">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li><li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells.">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287 (2002).</li><li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A.">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291 (2011).</li><li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes.">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li><li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels.">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li><li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened:+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process.">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li><li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La microscopie quantitative en biologie cellulaire est souvent associée à des tests d&#39;imagerie cellules vivantes telles que Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), etc. Cependant, il ya des exemples croissants de biologistes cellulaires développement différents tests de microscopie quantitative pour fixe cellules au cours des dernières années 27,34-36. Fait important, les progrès dans la compréhension de la biologie cen...

Centrosomes sont constitués d&#39;une paire de centrioles entourées par un matériau péricentriolaire (PCM). Étant les principaux centres d&#39;organisation des microtubules (de MTOCs) dans les cellules de mammifères, centrosomes servent les deux pôles de fuseau mitotique dans les cellules en division, et contribuent ainsi à maintenir l&#39;intégrité du génome 1. Dans les cellules au repos (par exemple, pendant la phase G0), l&#39;un des deux centrioles du centrosome, à savoir le centriole mère, est transformé en un corps de base pour assembler le cil primaire, un organite sensoriel faisant saillie de la surface de la cellule 2. Une fois les cellules re-entrer dans le cycle cellulaire, les cils primaires sont démonté et chaque centriole dirige l&#39;assemblage d&#39;un procentriole à son extrémité proximale qui se allonge progressivement pour former un centriole maturité 3. Au début de la phase S, une structure de roue en forme qui assure la symétrie neuf fois au centriole est formée sur la surface de chaque centriole existant et deviendra la base de chaque procentriole. SAS6 tchapeau est indispensable pour l&#39;assemblage de centriole est recruté pour former le moyeu de la roue 4-6. D&#39;autres protéines centriolaires sont ensuite assemblés sur la roue dans un très réglementé, de manière proximale à distale 7. Après avoir terminé précisément duplication centriole, les cellules se assemblent matériaux péricentriolaire supplémentaires pour construire deux centrosomes fonctionnels d&#39;ici la fin de la phase G2 8. En plus des composants principaux centriolaires 9-11, plusieurs autres protéines kinases, y compris, les phosphatases, chaperons, des composants d&#39;échafaudage, protéines associées à membrane et des machines de dégradation sont associés à des centrioles, les organismes de base et PCM à différents moments du cycle cellulaire 12-16. Il est souvent noté que les niveaux centrosomales de nombreuses protéines sont temporellement régulées par des mécanismes de ciblage centrosomales et / ou dégradation par le protéasome au centrosome. Fait important, les fluctuations du niveau centrosomale de plusieurs protéines telles que PLK4, Mps1, SAS6, et un CP110t différents points du cycle cellulaire semble être cruciale pour réguler ensemble de centriole 5,17-22, et dans le cas de Mps1 empêcher cette dégradation centrosomale conduit à la formation d&#39;excès centrioles 19. D&#39;autre part, les fractions centrosomales de plusieurs protéines sont moins labiles par rapport aux piscines cytosoliques. Par exemple siRNA médiée par régulation à la baisse de Centrin 2 (Cetn2) ne conduit à une diminution modérée de la teneur en protéines dans les centrioles malgré une grande réduction dans les niveaux de cellules entières 23. Il est donc crucial pour mesurer les changements dans le niveau de protéines centrosomales au centrosome plutôt que de mesurer l&#39;ensemble des niveaux de protéines de la cellule lors de l&#39;évaluation de leurs fonctions spécifiques centrosome. Dans cette étude, nous avons développé un test par immunofluorescence indirecte (IFI) pour quantifier le niveau relatif d&#39;une protéine au centrosome. Cet essai a été développé en particulier pour analyser les cellules qui sont de différents échantillonset ainsi ne peut pas être imagée en même temps. Ces échantillons peuvent être des cellules qui ont été traitées avec différents réactifs (ce est à dire, un médicament par rapport au témoin), recueillies à différents points dans le temps (ce est à dire, le pouls contre la chasse), ou sont dans différentes phases du cycle cellulaire. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région et pour normaliser la valeur contre le même pour une autre protéine dont le niveau ne varie pas dans les conditions expérimentales choisies. Plusieurs études de la biologie des centrosomes ont récemment utilisé diverses techniques de microscopie quantitative, dans les deux cellules vivantes ou fixées, afin de déterminer la fonction spécifique du centrosome de protéines candidates 24-27. Similaires à ceux des essais, la présente technique mesure aussi l&#39;arrière-plan corrigé intensité de fluorescence de la protéine d&#39;essai. Toutefois, l&#39;inclusion de la normalisation en utilisant un standard interne dans cet essai aurait probablement offrir une plus grandela précision et la confiance dans l&#39;analyse de deux échantillons différents qui sont sur deux lamelles différentes. En outre, en plus de l&#39;examen de la protéine au niveau de centrosomes, avec des ajustements mineurs ce procédé peut être appliqué à un ensemble diversifié de conditions expérimentales ou à d&#39;autres sites cellulaires. Ici, nous combinons notre analyse quantitative de microscopie avec une stratégie pulse-chase BrdU de comparer les cellules à différents stades du cycle cellulaire. Au lieu d&#39;utiliser des techniques d&#39;arrêt du cycle cellulaire standard et libération d&#39;étudier divers moments du cycle cellulaire, les cellules en croissance de manière asynchrone sont incubées avec BrdU pour marquer les cellules en phase S, et les cellules marquées sont chassés pendant divers temps (typiquement 4-6 heures). La plupart des cellules marquées seront en phase S immédiatement après l&#39;impulsion. La longueur de la chasse est choisi de manière que, après la chasse, cellules marquées seront à la fin de S, G2, ou mitose, qui peut être vérifié par des caractéristiques morphologiques telles de position as- du centrosome par rapport à nuclei, la distance entre les centrosomes, la condensation des chromosomes, etc. Ainsi, la longueur de la chasse dépend de la durée moyenne de S, G2 et M phase d&#39;un type cellulaire particulier. Étant donné que cette approche évite les inhibiteurs du cycle cellulaire tels que l&#39;hydroxyurée, l&#39;aphidicoline, nocodazole, etc., il permet une analyse plus physiologiquement pertinente du cycle cellulaire. Ainsi, nous démontrons ici que le dosage quantitatif de la microscopie par fluorescence seul, ou en combinaison avec BrdU test pulse-chase, est une technique simple mais puissant pour mesurer avec précision les changements relatifs dans le niveau centrosomale d&#39;une protéine de candidat pendant une cycle cellulaire imperturbable. Nous avons mesuré le niveau de centrosomale VDAC3, une protéine que nous avons récemment identifié au centrosomes en plus de mitochondries 16,28, l&#39;utilisation de ces tests. Les résultats obtenus ici vérifier notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est régulée par la dégradation, et varie également en un dependen du cycle cellulairet 16 manière, la validation outre l&#39;applicabilité de cette méthode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Catalog number</td>
			<td style="width:195px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">F8141</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">DMSO</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">D2650</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">MG115</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">SCP0005</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">BrdU</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B5002</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T 6557</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aviva Systems Biology</td>
			<td style="width:99px;">ARP35180-P050</td>
			<td style="width:195px;">1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Santa cruz biotechnology</td>
			<td style="width:99px;">sc-81431</td>
			<td style="width:195px;">1:100 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab-75005</td>
			<td style="width:195px;">1:500 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-BrdU (rat monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab6326</td>
			<td style="width:195px;">1:250 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21093</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21202</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21203</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21206</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21207</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T5192</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T9026</td>
			<td style="width:195px;">1:20000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A10043</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Mouse IgG (H&#38;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td>
			<td style="width:105px;">Rockland antibodies</td>
			<td style="width:99px;">610-731-002</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">SlowFade Gold Antifade Reagent&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">S36936</td>
			<td style="width:195px;">Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Round coverslips 12CIR.-1</td>
			<td style="width:105px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:99px;">12-545-80</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Olympus IX-81 microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td>
			<td style="width:105px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:99px;">32-0082B-238</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">100X Plan Apo oil immersion objective</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;">1.4 numerical aperture</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Slidebook software package</td>
			<td style="width:105px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Odyssey IR Imaging System</td>
			<td style="width:105px;">Li-cor Biosciences</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Bicinchoninic acid (BCA) assay</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow UV cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M622</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Blue cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M643</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Green cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M663</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Centrosomes sont petits mais importants organites qui servent de pôles de fuseau mitotique pour maintenir l&#39;intégrité génomique ou assembler les cils primaires pour faciliter les fonctions sensorielles dans les cellules. Le niveau d&#39;une protéine peut être réglé différemment au centrosome que dans d&#39;autres endroits .cellular, et la variation du niveau centrosomale de plusieurs protéines à différents points du cycle cellulaire semble être crucial pour le bon régulation de l&#39;assemblage centriole. Nous avons développé un dosage quantitatif microscopie fluorescence qui mesure les changements relatifs dans le taux d&#39;une protéine dans des centrosomes dans des cellules fixées provenant de différents échantillons, comme à différentes phases du cycle cellulaire ou après le traitement avec divers réactifs. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région, et qui normalise la même mesure par rapport à une autre protéine qui ne varie pas dans le cadre du c expérimental choisiondition. Utilisant cet essai en combinaison avec impulsion de BrdU et la stratégie de la chasse à étudier cycles cellulaires non perturbés, nous avons quantitativement validé notre récente observation que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire, vraisemblablement par la dégradation par le protéasome spécifiquement au centrosome.

Nos études récentes ont identifié roman localisation centrosomale et la fonction de VDAC3, l&#39;un des porines mitochondriales 16,28. Immunocoloration de plusieurs cellules de mammifères y compris les cellules RPE1 utilisant un anticorps spécifique VDAC3 a présenté une coloration centrosomale proéminent et relativement faible coloration mitochondriale. Nous avons également montré que VDAC3 centrosomale est préférentiellement associée à la centriole mère, et la piscine centrosomale à la fois e...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K vues.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

Vidéo: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l&#39;évolution des intensités de lumière

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Recherche

Biologie

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes d&#39;imagerie dans Fly testicules

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

L&#39;utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...