Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines fluorescentes telles que la façon dont les protéines fluorescentes peuvent affecter leurs partenaires de fusion. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une évaluation rapide et facilement évolutive des effets des protéines fluorescentes et de leurs partenaires de fusion. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du comportement des protéines fluorescentes, elle peut également être appliquée à d’autres étiquettes génétiquement codées.
Sonja Di Gregorio, étudiante diplômée de l’Université Western, démontrera également cette procédure. Chaque protéine fluorescente testée par cette méthode est d’abord clonée dans un vecteur d’expression de levure qui code une version inductible de galactose de l’exon HTT marqué FLAG, qui abrite soit la répétition non toxique de 25Q, soit la répétition toxique de 72Q associée à la maladie de Huntington. Les clones sont sélectionnés et vérifiés par séquençage et transformés par la suite en levure.
Pour préparer les cultures cellulaires pour les différents analyses, stries les clones de levure portant 25Q ou 72Q tag avec une protéine de fluorescence d’intérêt sur une plaque d’agar contenant milieu de sélection de levure avec du glucose comme source de carbone. Dans le même temps, la levure strie portant 25Q ou 72Q levure optimisé superfolder monomère GFP pour servir de contrôle positif. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.
Sélectionnez jusqu’aux trois colonies simples de chaque plaque et inoculer cinq millilitres de milieu synthétique complet complété par 2% de glucose comme source de carbone. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, transférez 200 microlitres de chaque culture nocturne dans un tube de microcentrifugeuse et une centrifugeuse pour pelleter les cellules.
Laver au moins trois fois avec de l’eau distillée stérile. Il est important de bien laver les cellules pour éliminer toutes les traces de glucose qui pourraient contribuer à réprimer l’induction du promoteur GAL1. Préparer les cellules comme démontré précédemment et les suspendre à nouveau dans un milieu synthétique complet contenant 2% de galactose comme source de carbone pour induire l’expression de fusions polyQ.
Comme un contrôle, re-suspendre les cellules dans les médias contenant du glucose. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius dans un rotateur à tube pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 600 nanomètres de chaque culture à l’aide d’un spectrophotomètre.
Égaliser les densités cellulaires à une densité optique de 600 sur 2 sur 100 microlitres de milieu synthétique complet dans une plaque stérile de 96 puits. Préparer quatre dilutions quintuplés de chaque échantillon en pipetant 20 microlitres de l’échantillon du puits précédent en 80 microlitres de médias dans le puits suivant. Utilisez un outil d’épinglant de levure pour repérer les cellules sur des plaques sélectives et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux jours.
Imagez les plaques avec un dispositif de documentation d’image. Préparez les cultures cellulaires pour cet essai, puis mesurez l’OD600 de chaque culture à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer les cellules à un OD600 de 1 sur 300 microlitres de médias dans la plaque de 96 puits.
Préparer chaque échantillon en triplicate. Incuber la plaque dans un incubateur de lecteurs de plaques avec des capacités de secousse. Réglez le nombre d’échantillons, la température à 30 degrés Celsius, l’absorption à 600 nanomètres, la durée des expériences à 24 heures, et les intervalles de mesure à 15 minutes.
Sélectionnez le mode de secousse continue. Lorsque l’expérience est terminée, créez la courbe de croissance et quantifiez la zone sous la courbe à l’aide d’un logiciel graphique scientifique. Coller les données dans une table XY avec trois valeurs de répétition.
La courbe de croissance sera affichée sous le dossier graphiques sur le côté gauche. Pour quantifier la zone sous la courbe, sélectionnez analyser en haut à gauche et cliquez sur la zone sous courbe dans les analyses XY. Commencez cette procédure en diluant les cellules préparées 10 fois dans le milieu de croissance.
Transférer 200 microlitres de chaque échantillon dans une chambre d’imagerie de huit puits. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent standard à champ large. Ajustez les paramètres d’imagerie pour l’acquisition d’images.
Étant donné que les agrégats 72Q sont beaucoup plus lumineux que le signal diffus de 25Q, il est souvent nécessaire d’utiliser un réglage d’acquisition différent entre les différents plasmides afin d’éviter la saturation du signal fluorescent. Traitez les images à l’aide d’un logiciel approprié de traitement d’image. Dans ce protocole, la tache de point est employée pour examiner des niveaux d’expression de protéine.
Préparez le tampon pour générer des lysates protéiques en ajoutant quatre micromolaires de fluorure de phényléthylsulfonyl et un cocktail inhibiteur de la protéase au tampon de lyse. Pelleter cinq millilitres de chaque culture nocturne par centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules dans 200 microlitres de perles de verre et 200 microlitres de tampon de lyse.
Vortex pendant 30 secondes pendant 12 rounds, givrage entre les tours. Centrifugeuse à 12 000 fois G à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes et collecte le supernatant. Utilisez un appareil de microfiltration pour repérer des quantités égales de protéines totales sur une membrane de nitrocellulose.
Pré-mouiller la membrane avec PBS et assembler l’appareil. Connectez-le à une source de vide et assurez-vous que les vis sont serrées. Chargez les échantillons, allumez le vide et laissez l’échantillon filtrer à travers la membrane par gravité.
Éponger la membrane dans le lait 05%Tween 5% sans gras pendant 30 minutes. Incuber la membrane avec un anticorps anti-drapeau primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec PBS 05%Tween.
Incuber la membrane avec un anticorps secondaire étiqueté fluorescent dans le PBS 05%Tween 5% de lait sans gras à température ambiante pendant une heure. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec PBS 05%Tween. Par la suite, imagez la membrane à l’aide d’un système de documentation de tache d’aminé.
Levure exprimant soit 25Q ou 72Q HTT exon on fusionné à la levure optimisé superfolder monomérique GFP ou levure optimisé tag monmérique BFP2 a été cultivé dans le glucose ou galactose milieu pendant la nuit et soit repéré sur des plaques d’agar ou incubé plus loin dans les médias liquides. Tandis que la levure de 72Q a optimisé le superfolder monomérique GFP induit un défaut significatif de croissance. 72Q levure optimisée étiquette monomère BFP2 affiche un phénotype de croissance similaire aux homologues non toxiques 25Q indiquant que la nature de l’étiquette fluorescente peut entraver le comportement d’expansion du polyQ dans les cellules.
L’évaluation de l’agrégation des fusions fluorescentes de polyQ par microscopie fluorescente montre que le superfolder monomérique optimisé de levure 72Q GFP affiche l’agrégation significative, alors que la levure de 72Q a optimisé l’étiquette monomère BFP2 affiche un signal cytoplasmique diffus semblable aux contreparties non toxiques de 25Q. Puisque les niveaux d’expression des diverses fusions de polyQ pourraient affecter la toxicité, des taches de point ont été exécutées pour évaluer des niveaux de protéine. Les résultats des dilutions quintuplentes des lysates cellulaires sont montrés.
N’oubliez pas que cette technique permet une comparaison rapide des protéines non caractérisées et fluorescentes avec les variantes GFP, mais elle ne peut pas évaluer directement l’oligomérisation. Après cette procédure, d’autres mesures, par exemple, l’analyse de l’ulcère dans les cellules mammifères peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que l’état monomère des protéines fluorescentes.
