We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Surveillance transcellulaire épandage des protéines à prions comme par In Vivo imagerie time-lapse NOTE: Cultivez C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et lignées transgéniques selon des méthodes standard et de contrôler attentivement la température de la culture 47. <ol><li> Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine prion-like, marqués avec la protéine fluorescente rouge monomère (RDRF). Regardez cette vidéo qui montre comment utiliser la micro-injection 48. Pour plus de détails et les méthodes décrivant comment intégrer ces lignes extrachromosomiques, voir 49. </li><li> Préparer populations synchronisés par ponte ou de blanchiment selon les méthodes standard 50. <ol><li> Synchronisation par la ponte <ol><li> Transfert 10-20 adultes gravides sur une plaque et les laisser pondent des œufs pour les 1-2 heures. Retirer les adultes de la plaque et laisser la descendance grandir jusqu&#39;à l&#39;âge désiré. </li></ol></li> &lt;li&gt; Synchronisation par le blanchissement <ol><li> Recueillir une population non synchronisé des adultes gravides et de les blanchir avec une solution alcaline d&#39;hypochlorite (NaOH 250 mM et 1: 4 (v / v) la dilution d&#39;eau de Javel commerciale en H 2 O). Lavez les œufs deux fois (218 g pendant 1 min) avec le tampon M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, une mMMgSO 4 · 7H 2 O, ajoutez dH 2 O jusqu&#39;à 1 L). </li><li> Permettez-leur d&#39;éclore dans un tampon M9 avec agitation douce O / N à 20 ° C. le développement de Worm arrêtera au stade L1 en l&#39;absence d&#39;une source de nourriture, laissant une population synchronisée. Transfert N1 sur frais nématodes croissance médias (NGM) plaques ensemencées avec OP50 E. coli et bactéries permettent de développer la descendance jusqu&#39;à 47 l&#39;âge désiré. </li></ol></li></ol></li><li> Préparer tampons d&#39;agarose à 2% (en H 2 O) sur une lame de microscope 50 comme décrit. <ol><li> Préparer deux kmdiapositives croscope avec du ruban d&#39;étiquetage placé sur toute leur longueur à être utilisés comme entretoises. Placez tiers lame de microscope entre eux. </li><li> Dissoudre 2% d&#39;agarose en H 2 O et une pipette goutte sur la lame propre. </li><li> Placez quart diaporama perpendiculaire aux trois autres diapositives sur le dessus de la chute agar. Appuyez doucement sur pour aplatir le pad pour la même épaisseur que la bande d&#39;étiquetage. </li><li> Laissez sécher pendant 1 min avant de retirer les entretoises et en tirant doucement les lames dehors. Le pad agar se en tiendra à l&#39;un d&#39;eux. </li></ol></li><li> Introduire à la pipette 10 ul ~ anesthésique (2 lévamisole mM dans du tampon M9) sur le tampon et le transfert ~ 10 animaux en utilisant une pointe de fil de platine. Couvrir avec une lamelle (~ 22 x 22 mm) et de prendre des images dans une heure. </li><li> Alternativement, d&#39;acquérir des films sur une période de temps plus ou pour réduire davantage la possibilité de tout mouvement des animaux, utiliser une combinaison d&#39;anesthésique et le talon 51 immobilisation. <ol><li> Préparer 10% agatampons rose (dans du tampon M9) comme décrit 51 ajouter et vers solution à 3 ul de standards de taille de nanosphères (billes de polystyrène, de 100 nm) plus 3 ul d&#39;anesthésie (4 lévamisole mM dans du tampon M9). Couvrir délicatement avec une lamelle. Pour éviter la dessiccation, sceller la lamelle avec valap (mélange de quantités égales de la vaseline, de la lanoline, la cire de paraffine). </li></ol></li><li> Image en immobilisée vers l&#39;utilisation d&#39;un microscope confocal. NOTE: Les résultats sont obtenus en utilisant un disque Spinning AF microscope confocal équipé d&#39;une caméra EM-CCD et un logiciel Microscopie Automation &amp; Analyse d&#39;image tels que MetaMorph et décrivent les détails ci-dessous, mais d&#39;autres systèmes d&#39;imagerie confocale comparables peuvent également être utilisés. <ol><li> Utilisez l&#39;objectif 63X ou 100X / 1.4NA pétrole et placer la lame de microscope contenant des vers dans le support de lame de microscope. </li><li> Ouvrez le logiciel. Régler la puissance du laser et des filtres pour l&#39;imagerie mRFP. Utilisez le laser 561 nm à 10% de la puissance et l&#39;émission filtre&gt; 600 nm. </li><li&gt; Ouvrir &quot;MultiDimensional acquisition». Sous l&#39;onglet &quot;Principal&quot;, cochez les cases pour &quot;Timelapse» et «Run Journals&quot; (Hardware Auto Focus: off). </li><li> Sous l&#39;onglet &quot;Enregistrement&quot; sélectionner ou créer le dossier du répertoire où les fichiers doivent être sauvegardés. Attribuez un nom au fichier. </li><li> Sous l&#39;onglet &quot;Wave Longueur&quot; sélectionnez l&#39;éclairage approprié et ajuster l&#39;exposition et gain. Utiliser &quot;YokoQuad Red&quot; (ou un réglage d&#39;éclairage pour l&#39;imagerie mRFP équivalent) avec une exposition entre 100 et 300 ms et un gain de la caméra entre 100 et 300, en fonction de l&#39;échantillon individuel (évaluée en utilisant l&#39;image en direct). </li><li> Sous l&#39;onglet «Timelapse», sélectionnez «Nombre de points de temps&quot; = 301, &quot;Durée&quot; = 5 min et &quot;Durée / Intervalle&quot; = 1 sec. </li><li> Dans le cadre du &quot;Journaux&quot; Sélectionnez l&#39;onglet Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; et &quot;AFC retour à Z HOLD&quot;, Type: &amp;# 8220; spécial &quot;(deux fois), point de départ:&quot; Début de l&#39;heure le point &quot;et&quot; Fin de point de temps. &quot; Cette option de mise au point est important pour l&#39;image de la même section sur une période de temps plus longue. </li><li> Lorsque l&#39;installation est terminée, appuyez sur &quot;Acquérir&quot;. La vidéo timelapse est Safed sous forme de fichiers TIFF séparés. </li><li> Ouvrez tous les fichiers .tiff d&#39;une série de temps donné dans ImageJ. Allez à &quot;Image&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Images à Stacks&quot;. Eventuellement, régler la luminosité et le contraste, ajouter une barre de taille, etc. exporter le film dans &quot;Fichier&quot; → &quot;Enregistrer sous&quot; → &quot;AVI ...&quot; (pour un exemple, voir la vidéo 1 et 2 correspondant à la figure 1). </li></ol></li></ol> 2. Utilisation de capteurs pliants et Reporters stress d&#39;enquêter cellulaire autonome et non cellulaire autonome affecte sur protéostasie et toxicité <ol><li> Générer des lignées transgéniques qui coexprimer un capteur de pliage ou de stress reporter avec la protéine prion-like. Pour les méthodes sur la façon d&#39;établir des croix ou de générer des lignées transgéniques, voir 48,49,52. Voir le tableau 1 pour une liste de C. elegans souches qui peuvent être utilisées. </li><li> Préparer populations synchronisées d&#39;animaux transgéniques et de les cultiver jusqu&#39;à l&#39;âge désiré comme décrit ci-dessus (section 1.2) 50. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un stéréomicroscope, d&#39;examiner le phénotype du capteur respectif de pliage ou de stress reporter. <ol><li> Pour le capteur de pliage, de déterminer le nombre d&#39;animaux hébergeant agrégats de chaque jour après la synchronisation (pour un exemple, voir la figure 2E et F). </li><li> Pour le journaliste de stress, test si la co-expression des résultats de protéines prion-like dans une fluorescence accrue de la journaliste (pour un exemple, voir la figure 3). </li></ol></li></ol> 3. Écran d&#39;échelle du génome pour la répression de la toxicité induite Prion-en C. elegans<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figure 4. Représentation schématique du protocole de dépistage ARNi. Voir la section 3 du protocole pour une description détaillée des étapes individuelles. <ol><li> Synchronisation de C. vers elegans et le dédoublement de la bibliothèque de l&#39;ARNi <ol><li> Pour l&#39;écran ARNi, utiliser la bibliothèque Ahringer ARNi (ou la bibliothèque Vidal ARNi) 53,54. Rearray la bibliothèque de l&#39;ARNi 384 format bien d&#39;origine dans des plaques 96 puits en remplissant les plaques avec 100 ul de milieu LB-amp (50 ug / ml d&#39;ampicilline dans LB) supplémenté avec 10% de glycerol et inoculer en utilisant un réplicateur à 96 broches. Croître à 37 ° CO / N avec agitation et conserver à -80 ° C. </li><li> Maintenir C. elegans WT et lignées transgéniques à 20 ° C sur des plaques NGM ensemencées avec OP50 E. bactéries coli selon des procédés standard 47. </li><li>Synchronisez le domaine de prion transgénique et WT (contrôle) nématodes par le blanchiment (voir section 1.2). </li><li> Le même jour que les vers sont blanchies, préparer milieu LB additionné de 50 ug / ml d&#39;ampicilline. Utilisez un distributeur de réactif automatisée à distribuer (ou d&#39;une pipette manuelle) 65 pi des médias LB-ampères dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Retirer 96 des plaques de bibliothèque Ahringer ARNi de -80 ° C et les amener à une hotte stérile avec des serviettes en papier. Immédiatement retirer le joint-bande en maintenant la plaque à l&#39;envers pendant plaques sont encore gelés, prenant soin d&#39;éviter la contamination de la glace à l&#39;extérieur des plaques. Reinvert les plaques et laissez-les décongeler pendant environ 30 min. </li><li> Trempez une stérile 96 broches réplicateur dans une plaque bibliothèque ARNi, puis dans une plaque LB-ampères frais. Utilisez un réplicateur frais stérile pour chaque plaque. Sceller toutes les plaques avec du papier adhésif et retourner les plaques de la bibliothèque à -80 ° C. Les réplicateurs peuvent être trempées dans l&#39;eau de Javel, rincées,et passé à l&#39;autoclave pour être utilisé à nouveau. </li><li> Permettre plaques ARNi doubles de croître O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C et 300 rpm. Pour utiliser HT115 E. coli bactéries hébergeant le vecteur vide (L4440) comme témoin, se développent séparément dans un tube de culture puis pipeter 65 pi de la culture avec une pipette multicanaux en quart de deux plaques à 96 puits. </li></ol></li><li> Induction de la production bactérienne ARNdb et l&#39;ajout de vers <ol><li> Diluer isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration de 5 mM dans ddH 2 O. Utilisez un poste de travail automatisé avec une tête multicanal à distribuer (ou une pipette manuelle) 10 pi de IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et les plaques de contrôle. Refermer et placer les plaques de nouveau dans l&#39;incubateur. Qu&#39;ils tremblent pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Alors que les bactéries sont tremblaient, préparer les vers. Mélanger le / ver suspension M9 bien, et la pipette un petit échantillon (~ 5-10 pi) sur une lame de microscope en verre. Compterle nombre de vers sous un stéréomicroscope et de calculer le nombre de vers par ul. </li><li> En utilisant une technique stérile, préparer une solution de M9 supplémenté (M9 +) avec les concentrations finales suivantes: 0,20 mg / ml d&#39;IPTG, 8,0 ug / Cholestérol ml, 50 pg / ml d&#39;ampicilline, 9,6 pg / ml de tetracycline, 0,0835 ug / ml de Fungizone, et 15 vers par 50 ul. <ol><li> Faire des solutions séparées pour le domaine de prion transgénique et les vers WT. Le volume final de la solution de ver M9 + nécessaire dépendra du nombre de plaques ARNi copiés (voir ci-dessous), plus ~ 30 ml de volume mort qui restera dans le réservoir, si un distributeur automatique est utilisé. </li></ol></li><li> Après l&#39;induction de 3 h de la production bactérienne ARN double brin, prendre les plaques de l&#39;incubateur et laisser refroidir à température ambiante (~ 30 minutes) pour éviter la chaleur soulignant les animaux. </li><li> Distribuer M9 + solution de ver transgénique de domaine prion de 50 ul à chaque puits des plaques ARNi et l&#39;une des plaques de lutte antivectorielle vides. FaireAssurez-vous de mélanger la solution à vis sans fin, avant chaque étape que les animaux ont tendance à sédimenter au fond du réservoir. </li><li> Distribuer vers WT dans la seconde plaque de commande. Laissez les plaques non scellées pour permettre l&#39;aération. Pour garder la culture liquide de se évaporer, empiler 4-5 plaques ensemble et enveloppez-les avec une serviette en papier humide et une feuille d&#39;aluminium. Incuber à 200 tours par minute à 20 ° C pendant 4 jours. </li></ol></li><li> Points NOTE: Après 4 jours dans l&#39;incubateur, les vers seront à la deuxième journée de l&#39;âge adulte et sont prêts à l&#39;écran. Laissez les animaux à se adapter à des conditions non secousse pendant 30 min avant de dépistage pour se assurer volée sans être dérangé. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil Falcon 4M60 connecté à un ordinateur avec un moniteur, écran visuellement augmenté volée par rapport aux témoins traités domaine prion animaux transgéniques. </li><li> Dresser une liste de hits préliminaires pour confirmer utilisant wrMTrck (voir la section suivante). </li></ol></li></ol> 4. Confirmation de préliminaireVisites écran <ol><li> Motilité test sur des plaques solides <ol><li> Préparer des plaques NGM avec supplémenté avec 100 ug / ml d&#39;ampicilline, 12,5 ug / ml de tetracycline et 1 mM d&#39;IPTG, selon des procédés standard 47. Si possible, utilisez une machine en forme de plaque de coulée pour assurer toutes les plaques ont la même hauteur des médias, ce qui permettra un processus d&#39;acquisition vidéo plus simple. </li><li> Cultiver les différents clones d&#39;ARNi dans ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml d&#39;ampicilline, O / N à 37 ° C et 250 tours par minute. </li><li> Le lendemain, induisent l&#39;expression de l&#39;ARN double brin avec IPTG 1 mM pendant 3 heures. Ensemencer les plaques avec 150 pi de chaque clone bactérien ARNi, répartis dans une couche mince. Que les bactéries sèches pendant 2 jours à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Préparer 3 plaques par ARNi clone. </li><li> Synchroniser la population du ver par blanchiment selon des méthodes standard 50 (voir section 1.2), et de laisser les œufs éclosent O / N dans des milieux M9. </li><li> Prélever un échantillon de la suspension de vis sans fin et déterminer le montant de nematodes par ul à la loupe binoculaire. Puis, une pipette le bon volume de M9 ainsi vers dans chaque plaque expérimentale de sorte qu&#39;il contient 25 à 30 vers L1. Cultivez les nématodes à 20 ° C pendant quatre jours jusqu&#39;à ce que les vers atteignent deux jours de l&#39;âge adulte. </li></ol></li><li> L&#39;analyse quantitative de ver motilité avec le plugin pour ImageJ wrMTrck REMARQUE: Les vidéos ont été enregistrés en utilisant un stéréomicroscope à un grossissement de 10X avec un Hamamatsu Orca-R2 appareil photo numérique C10600-10B et le logiciel d&#39;imagerie PCI simple Hamamatsu. <ol><li> Allumez l&#39;appareil photo et le logiciel d&#39;imagerie PCI simple. Cliquer sur &quot;direct&quot; pour permettre le réglage des conditions de formation d&#39;image. </li><li> Mettre en place les conditions vidéo comme suit: Gain = 0; Mode Voyant = haut; Indice de vitesse = 1; Binning = 2. Cliquez sur «Exposer Auto», puis ajuster les conditions d&#39;éclairage, le déplacement des miroirs de microscope et la luminosité et le contraste cadrans. REMARQUE: La vidéo doit avoir un contraste élevé sans être EXPOSED, de sorte que les animaux affichent comme des formes noires sur un fond clair. </li><li> Cliquez sur &quot;Scan Time&quot; et choisissez un dossier et un nom de fichier. Réglez &quot;Champ Delay&quot; à 20 ms et &quot;Arrêtez-vous à l&#39;heure&quot; à 30 sec. Appuyez sur &quot;Revoir Live&quot; pour choisir la zone de la plaque d&#39;enregistrer (où la plupart des vers sont). Appuyez sur la plaque 3 ou 4 fois sur la scène, rapidement confirmer sa position dans le champ de vision et appuyez sur &quot;Démarrer&quot;. </li><li> Après le film a fini d&#39;enregistrer, cliquez droit sur l&#39;image et choisissez &quot;Exporter Montage Séquence&quot; pour exporter le film d&#39;un format à un .cxd .avi. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des vidéos de la motilité <ol><li> Ouvrez le logiciel ImageJ, allez dans l&#39;onglet &quot;Plugins&quot;, puis &quot;wrmtrck&quot; et sélectionnez &quot;Batch wrMTrck&quot;. Sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser. </li><li> Dans la fenêtre de wrMTrck_Batch d&#39;entrée principale, charger les valeurs d&#39;entrée comme détaillé dans Figure 5C. Explication pour chacun des paramètres peut être trouvée dans les instructions qui accompagnent le plugin. Cliquez sur &quot;OK&quot; et laisser l&#39;analyse du mouvement terme. </li><li> Pour prendre soin des résultats et de confirmer que toutes les pistes sont détectées à partir réelle C. elegans et éliminer les artefacts, ouvrir chacun des fichiers .txt créés pour chaque film et de copier les informations dans un fichier de logiciel d&#39;analyse de données. Ouvrez les &quot;*&quot; _labels.zip fichiers créés et exécutez le résultat &quot;* _labels.tif&quot; pour vérifier et éliminer les pistes de vers de fausses manuellement. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Les procédés décrits ici permettent d&#39;illustrer la propagation cellulaire et la toxicité de la cellule autonome et non autonome complexe de protéines prion-like. Nous avons récemment découvert que un domaine prion cytosolique agrégation sujette est repris dans des vésicules membranaires dans un processus d&#39;autophagie liés. Un sous-ensemble spécifique de ces vésicules transporte le domaine de prion dans et entre les cellules et les tissus 40. La clé pour contrôler leur mouvement dans l&#3...

Beaucoup de maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (PD), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), sont associés à des protéines d&#39;agrégation sujette et sont donc collectivement connus comme mauvais repliement des protéines troubles (PMD ). EST ou maladies à prions constituent une classe unique de PMD en ce qu&#39;ils peuvent être infectieux chez les humains et les animaux 1. Au niveau moléculaire, les prions répliquent par le recrutement et la conversion de monomère α-hélice riche PrP cellulaire codée par l&#39;hôte (PrP C) dans le pathologique β-feuille riche PrP Sc conformation 2,3. agrégats auto-propagation protéines ont également été identifiés dans les champignons, qui partagent des caractéristiques importantes des prions de mammifères 4,5. En outre, les prions de mammifères sont capables de se déplacer de cellule à cellule et infectent les cellules naïves 6,7. Alors que PMD OTHer que les EST ne sont pas infectieux, ils partagent un principe pathogène commun avec les maladies à prions 8,9. Bien que les protéines liées à chacun des PMD ne sont pas liés dans la structure ou la fonction, ils tous les agrégats de formulaire via un processus de cristallisation comme appelés nucléé ou la polymérisation ensemencées; ailleurs semences protéiques grandir en recrutant leurs isoformes solubles 2,10,11. L&#39;efficacité de l&#39;auto-propagation in vivo varie, en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, qui, avec d&#39;autres facteurs cellulaires tels que les chaperons moléculaires finalement déterminer les taux de nucléation agrégat, l&#39;ensemencement, la fragmentation et la diffusion de 12 à 15. Par conséquent, il doit exister un juste équilibre entre ces facteurs qui permet la propagation efficace de l&#39;agrégation des protéines. Cela pourrait aussi expliquer pourquoi seuls certains agrégats amyloïdogéniques abritent les caractéristiques d&#39;un prion, et donc tous les PMD sont infectieux. Prions semblent représenter l&#39;o &#39;top-interprètesfa large éventail d&#39;agrégats protéiques auto-réplication, qui en fait un outil puissant pour étudier PMD 8,13. Curieusement, la toxicité associée aux agrégats liés à la maladie a souvent un composant non cellulaire autonome 16,17. Cela signifie qu&#39;ils affectent des cellules voisines qui ne expriment pas le gène correspondant, par opposition à un effet strictement cellule autonome, ce qui implique que seules les cellules exprimant le gène présentent le phénotype spécifique. Cela a été démontré de façon convaincante par l&#39;expression spécifique d&#39;un tissu ou d&#39;abattre les protéines respectives dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives 18-26. Divers mécanismes ont été suggérés comme une base pour cette toxicité autonome non-cellule dans les PMD, y compris l&#39;approvisionnement en éléments nutritifs diminué, déséquilibre dans la signalisation neuronale, excitotoxicité du glutamate et neuroinflammation 16,27,28. En outre, un mouvement de prion comme des agrégats de maladies liées entre cellules MIGHt contribuer à cet aspect 29,30. Des preuves croissantes suggèrent que les protéines autres que les inclusions peuvent transmettre prions de cellule à cellule, ce qui peut expliquer la propagation de la caractéristique de la pathologie observée dans de nombreux PMD 30-36. Cependant, il n&#39;a pas encore été déterminé se il existe un lien de causalité évident entre le mouvement intercellulaire de protéines de la maladie et l&#39;effet toxique sur les cellules voisines. Par conséquent, une meilleure compréhension des voies cellulaires qui sous-tendent la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome est nécessaire et essentiel pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques. Cependant, de nombreux aspects de prion-like facteurs d&#39;étalement et cellulaires qui influencent la transmission des protéines mal repliées de cellule à cellule dans métazoaires ne sont pas bien comprises, en particulier au niveau de organismal. Le nématode Caenorhabditis elegans a plusieurs avantages qui fournissent le potentiel de découvrir de nouvelles facettes de prion-like spreading chez les métazoaires 17. Il est transparent, ce qui permet le suivi in vivo de protéines par fluorescence marqués dans l&#39;organisme vivant. En outre, de nombreux processus cellulaires et physiologiques touchées par la maladie sont conservés des vers pour la santé humaine, et C. elegans est également prête à une grande variété de manipulations génétiques et les analyses moléculaires et biochimiques de 37 à 39. Exactement 959 cellules somatiques constituent l&#39;hermaphrodite adulte avec un plan de corps simple qui a encore plusieurs types de tissus distincts, y compris musculaires, les neurones et l&#39;intestin. Pour établir un nouveau modèle de prion en C. elegans, nous avons choisi d&#39;exprimer la glutamine exogène / asparagine bien caractérisés (Q / N) riche prion domaine NM de la protéine cytosolique levure prion Sup35, car il n&#39;y a pas de protéines prions endogènes connus vers 4,40. prions de levure ont été inestimables pour élucider les mécanismes de base de la réplication du prion 41-44. En outre, NM est le sapinst cytosolique protéine prion-like qui a été montré pour récapituler le cycle de vie complet d&#39;un prion dans la culture de cellules de mammifères 45,46. De même, lorsqu&#39;il est exprimé dans C. elegans, le domaine de prion Sup35 adoptée remarquablement bien aux différentes exigences pour la propagation dans les cellules de métazoaires par rapport à des cellules de levure et les principales caractéristiques exposées de la biologie du prion agrégation 40. NM a été associée à un phénotype toxique profonde, y compris la perturbation de l&#39;intégrité mitochondriale et l&#39;apparence de diverses vésicules autophagie liés au niveau cellulaire, ainsi que l&#39;arrestation embryonnaire et larvaire, retard de développement, et une perturbation généralisée de l&#39;environnement de repliement des protéines au niveau de organismal. Étonnamment, le domaine de prion cellulaire présente une toxicité cellulaire autonome et non autonome, affectant les tissus avoisinants, dans lequel le transgène ne est pas exprimé. En outre, le transport vésiculaire du domaine des prions dans et entre les cellules est surveillée en temps réel &lt;em&gt; in vivo 40. Nous décrivons ici comment examiner prion-like diffusion en C. elegans. Nous allons vous expliquer comment surveiller le transport intra et intercellulaire de vésicules contenant le domaine de prion utilisant time-lapse microscopie à fluorescence. Nous mettrons l&#39;accent sur l&#39;utilisation de capteurs de pliage tissu-spécifiques et exprimée de manière ubiquitaire journalistes de stress pour évaluer les effets cellulaires autonomes cellules autonomes et non sur la forme physique cellulaire. Enfin, nous allons décrire la procédure d&#39;un écran récemment effectué du génome grande interférence ARN (ARNi) pour identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par le prion. En combinaison, ces méthodes peuvent aider à démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire de protéines et de leur toxicité autonome non cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Suivi intercellulaire propagation de protéines prion-like in vivo par imagerie time-lapse Transgénique C. elegans lignes exprimant le domaine des prions sont particulièrement bien adaptées pour l&#39;analyse de certains aspects de protéines prions en forme, par exemple, la transmission de cellule à cellule et la toxicité non autonome cellulaire. La transparence des animaux permet un suivi de fluorescence protéines marquées au sein de l&#39...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans at JoVE.com

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K vues.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Vidéo: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissection et d&#39;enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.