Ce protocole fournit un système peu coûteux et adaptable pour évaluer la dynamique temporelle des indices fluorochimiques sur Colletotrichum fiorniae et d’autres pathogènes végétaux qui infectent la floraison à terme. De nouveaux dispositifs de collecte de l’eau de pluie au sol permettent à l’utilisateur de surveiller les stimulants naturels et les conditions affectant le développement d’agents pathogènes d’une manière presque en temps réel propre au site. Commencez cette procédure avec une culture de Colletotrichum fiorniae à partir d’un hôte naturellement infecté tel que décrit dans le protocole de texte.
Lorsque les colonies commencent à sporulate, conidia strie sur un autre V 8 Juice agar contenant plat de culture cellulaire pour produire une culture de sporulation à haute densité. Après sept jours de croissance, utilisez une boucle stérile standard pour recueillir une petite quantité de conidie de la culture à haute densité en touchant légèrement la boucle à la masse conidiale. Remuez-le dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’eau déionisée stérile.
Vortex cet échantillon pendant 10 secondes. À l’aide d’une pipette standard, plongez de haut en bas à de nombreuses reprises pour mélanger davantage l’échantillon. Placez ensuite une goutte de l’échantillon vortexé sur l’hémocytomètre et estimez les concentrations de spores.
Ajuster la concentration à 0,1 million de conidies par millilitre d’eau distillée stérile avec un volume final de cinq millilitres. C’est ce qu’on appelle la suspension des spores et n’est effectuée que immédiatement avant l’utilisation dans l’un ou l’autre bioassay. Pour effectuer l’extraction florale à base de chloroforme, nettoyez tous les composants avec 95 % d’éthanol deux fois.
Nettoyez ensuite les composants deux fois avec du chloroforme pour éviter la contamination pour chaque extraction. Ne nettoyez pas les bouchons doublés PTFE de chloroforme car cela les endommagera. Après le nettoyage, mettre les composants de côté pour sécher à l’envers.
Dans un bécher, mélanger une partie des fleurs transformées en neuf parties de chloroforme en ajoutant des fleurs, puis du chloroforme. Faites pivoter doucement pendant 30 secondes et filtrez à travers un écran en acier inoxydable dans le deuxième bécher. Verser l’extrait à base de chloroforme du deuxième bécher dans le tube de culture du verre et apposer le bouchon PTFE.
Envelopper le bouchon avec du parafilm pour éviter l’évaporation. Conservez l’extrait floral à base de chloroforme qui en résulte dans l’obscurité pour réduire la dégradation de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir des répliques.
Pour créer un dispositif de collecte pour chaque emplacement sélectionné, utilisez un peu d’étape attaché à une presse de forage pour percer un trou au fond d’une tasse de pulvérisation. Ensuite, couper une ligne droite du haut du trou à la bouche de la tasse de pulvérisation. Percez maintenant quatre trous équidistants assez grands pour enfiler le fil enduit de plastique à l’embouchure de la tasse de pulvérisation.
Fixez une extrémité des fils enduits de plastique en laissant une extrémité libre. Percer un trou suffisamment grand pour enfiler le spray de peinture ou l’adaptateur de tasse dans un couvercle de bouchon de centrifugeuse de 50 millilitres. Sceller les fils de l’adaptateur avec du parafilm pour éviter les fuites.
Attachez-le à la fois au bouchon de centrifugeuse et à la partie filetée de la tasse du pulvérisateur. Attachez ensuite le tube de centrifugeuse de 50 millimètres. Créez quatre appareils de collecte par lieu d’échantillonnage.
Déployer des dispositifs à certains endroits en fléchissant des gobelets de pulvérisateur pour s’adapter aux tiges. Orientez le côté coupé de la tasse de pulvérisateur vers le haut à l’aide des fils enduits en plastique attachés à d’autres tiges. Cela garantit que l’eau qui passe au-dessus des fleurs est capturée.
Pour recueillir l’eau de pluie des fleurs de canneberges, la première perforation de chaleur huit trous équidistants autour de la bouche de l’entonnoir à l’aide d’une sonde métallique. Insérez des attaches de torsion dans quatre des trous. Fixez les autres extrémités à l’emplacement opposé de ce trou formant un modèle de croisement soigné.
Envelopper l’entonnoir à la vapeur avec du parafilm et réserver. Percer un trou assez grand pour insérer l’entonnoir vers le bas de la tige dans un bouchon de centrifugeuse de 50 millilitres avec un peu d’étape. Insérez l’entonnoir préparé dans le bouchon de centrifugeuse.
Après les précipitations ou l’irrigation aérienne, retirez et remplacez la partie inférieure du tube de centrifugeuse. Les tubes de collecte de l’eau de pluie doivent être rapidement changés après les événements de mouillage car ils sont sujets à la dégradation des contaminants naturels mobilisés dans le ruissellement comme les bactéries et autres champignons. Placer deux couches de disques de papier dans les plats de culture et tremper avec deux millilitres d’eau distillée stérile.
Ensuite, mélangez des volumes égaux d’eau distillée stérile et d’extrait floral à base d’eau dans deux tubes de microcentrifugeuse millilimétriques. Ajoutez ensuite un volume égal de la suspension de spores aux tubes de microcentrifugeuse préparés de deux millilitres. La préparation qui en résulte est appelée mélange de traitement aqueux.
Pour le contrôle, omettre la partie extrait florale et remplacer par de l’eau distillée stérile pour garder les concentrations conidiales cohérentes. Placez maintenant des couvre-toits en verre pré-nettoyés sur les serviettes en papier trempées dans le plat de culture cellulaire. Placer une gouttelette de 40 microlitres de mélange de traitement aqueux sur le centre d’un coverslip.
Répétez cette demande pour les traitements désirés, y compris le contrôle. Ensuite, fermez le plat de culture cellulaire. Une fois que tous les traitements et répliques ont été distribués, placez tous les plats de culture cellulaire répliqués dans un contenant en plastique scellé et incubez à 25 degrés Celsius dans l’obscurité.
Aux points de temps prédéterminés, ajouter 10 microlitres d’un fixateur aux gouttelettes arrêtant la croissance et semi-préservant la monture. Une fois qu’un fixatif a été ajouté, inversez soigneusement les coverslips plaçant chacun d’eux côté gouttelette vers le bas sur une glissière de microscope en verre pour faciliter l’examen microscopique. Lorsque tous les coverslips sont sur les glissières de microscope en verre, laissez-les s’installer et sécher partiellement dans le capot d’écoulement pendant 20 minutes.
Comptez toutes les conidies présentes sur le coverslip, y compris les conidies primaires, les conidies germées et les conidies secondaires nouvellement formées, ainsi que l’appressoria. Travaillez à 400 fois grossissement ou 200 fois totalisant une superficie de 3.808 millimètres carrés. Dans un capot d’écoulement laminaire, ajouter deux volumes égaux d’eau distillée stérile et un volume de suspension de spores à un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres.
Réserver ce mélange de traitement aqueux aux bioassays à base d’extrait floral à base de chloroforme. Dans une hotte de fumée, placez une cellule Van T sur un couvercle en verre dans le plat préparé de culture cellulaire en plastique. Distribuez 33 microlitres d’extrait floral à base de chloroforme désiré au centre de la cellule et laissez sécher.
Ne touchez pas aux parois de la cellule. Pour le traitement de contrôle, ajouter le chloroforme vierge. Une fois l’extrait floral à base de chloroforme séché, distribuez 99 microlitres du mélange de traitement aqueux préparé avec une pipette standard au centre de la cellule Van T.
Fermez ensuite tous les plats de culture cellulaire et incubez. Aux points de temps prédéterminés, ajouter 15 microlitres d’un fixatif à la cellule Van T et laisser reposer pendant au moins cinq minutes pour assurer une coloration fongique adéquate. Après ce délai, retirez soigneusement la cellule Van T.
Effectuez des étapes d’inversion de coverslip et d’acquisition de données comme auparavant. Sur l’évaluation microscopique de C.fiorniae à 24 heures après inoculation, la comparaison de conidia en présence de l’eau distillée stérile par rapport à l’extrait floral à base d’eau indique une augmentation dramatique de la conidiation secondaire et de la formation d’appressorium. Cependant, la conidiation secondaire n’était pas aussi évidente en comparant le contrôle stérile de l’eau distillée de bioassay de chloroforme aux extraits chloroformes-basés.
Au contraire, la croissance de C.fiorniae s’est déplacée vers la formation appressorial. Dans cet essai, un contrôle stérile de l’eau distillée et des extractions florales à base de chloroforme de canneberge ont été inspectés visuellement à zéro, six, 12 et 24 heures après l’inoculation. La formation d’appressorium a commencé à six heures dans l’extrait floral chloroforme-basé et a augmenté régulièrement tout au long des points suivants de temps.
Ce résultat appuie la conclusion que les fleurs réduisent le temps nécessaire pour former des structures d’infection. La gestion de la maladie pour les champignons pourris de fruits implique souvent des applications fongicides en période de floraison. Ici, des extraits chloroformes de canneberge-basés des étapes multiples de croissance de canneberge ont été visuellement évalués pour les cires efficaces de surface sur C.fiorniae à 24 heures après inoculation.
Les ovaires récoltés en juin, les fruits immatures récoltés en juillet et en août, les fruits récoltés en octobre et un contrôle stérile de l’eau distillée ont été inspectés pour décelé la formation appressoriale. Les extraits à base de chloroformeovaire avaient la plus grande magnitude de formation appressoriale indiquant l’importance de la floraison dans le cycle de vie de C.fiorniae. L’agent pathogène est l’élément le plus important de ce protocole.
Les champignons devraient être déplacés vers des médias frais régulièrement pour maintenir la cohérence entre les essais. Tout travail avec du chloroforme doit être effectué dans un capot de fumée pour des raisons de sécurité. Cela comprend la préparation des matériaux et de la verrerie, les procédures d’extraction et la conductance du bioassay à base de chloroforme.
Des combinaisons de points de temps, d’agents pathogènes, de collections florales d’eau de pluie ou d’extractions d’hôtes peuvent être utilisées pour évaluer diverses interactions hôte-pathogène. Les dispositifs de collecte de l’eau de pluie et les bioassays associés permettront à d’autres de travailler avec des stimulants hôtes mobilisés lors d’événements pluvieux dans de nombreux systèmes de chemin.
