Les colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire sont des outils importants pour l’analyse de la dynamique organelle et des cellules fongiques vivantes. Nos protocoles fournissent un contexte théorique essentiel et des lignes directrices pratiques pour l’application d’une sélection de ces colorants comme taches vraiment vitales. Le point clé pour cela est d’utiliser des concentrations de colorants très faibles qui ne causent pas d’artefacts cellulaires liés à la saturation ou la toxicité des colorants tout en fournissant de bons rapports signal/bruit pour l’imagerie cellulaire vivante de haute qualité et à long terme.
Avec des collègues du Département de médecine nucléaire de l’université médicale, nous avons récemment utilisé ces techniques de coloration pour développer une nouvelle approche pour le diagnostic guidé par l’image de l’aapergillose. La capacité de surveiller les structures des membranes et des paroi cellulaires en temps réel était cruciale pour déterminer la dynamique d’absorption du composé expérimental du médicament. Pour commencer cette procédure, d’abord obtenir une préculture préparée.
Utilisez un scalpel de stéril pour couper un petit bloc d’agar qui transporte le mycélium non sporulant du bord de la colonie de la préculture. Placez le bloc d’agar au centre d’une assiette moyenne fraîche et solide pour inoculer la culture expérimentale. Incuber la culture expérimentale selon le stade de développement destiné à être incubé.
La préparation de l’échantillon est quelque peu délicate et l’optimisation des paramètres d’acquisition d’images est assez complexe. La démonstration visuelle des deux procédures accompagnée de l’explication verbale facilite grandement la réplicabilité. Pour monter les échantillons, gardez un glissement de couverture en verre propre de 24 par 60 millimètres prêt et ajoutez 18 microlitres de solution de sel moyen ou physiologique minimal liquide sur le centre.
Ajouter deux microlitres de la solution de travail de teinture de 20 micromolaires préparée au liquide au centre de la feuille de couvercle et bien mélanger en pipetting de haut en bas à plusieurs reprises tout en évitant la production de bulles d’air. À l’aide d’un scalpel propre, découpez un échantillon de 15 par 15 millimètres de la périphérie de la colonie et placez-le verticalement à côté de la goutte moyenne sur le glissement de couverture. Utilisez le scalpel pour soutenir le bord supérieur du bloc et un doigt pour maintenir le côté arrière du bloc en place.
Puis, abaissez lentement le côté portant le mycélium sur le liquide. Montez l’échantillon préparé sur l’étape du microscope. Tout d’abord, ajustez les paramètres d’acquisition d’image de base pour capturer la dynamique debout dans les hyphes individuels tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte.
Pour les analyses d’absorption de l’endocytose, consultez la figure un et le tableau un du protocole texte pour identifier les meilleurs paramètres d’excitation et d’émission pour fm 143 ou FM 464 qui sont disponibles sur le système de microscopie et ajuster ces paramètres dans le système en conséquence. Commencez l’enregistrement d’images à l’aide des paramètres précédemment ajustés et évaluez les résultats. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition d’image à la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer l’aspect de la membrane plasmatique ou de la dynamique d’endocytose sur quoi l’expérience se concentre.
Pour la dynamique de la paroi cellulaire, consultez la figure quatre et le tableau un du protocole textuel afin d’identifier les meilleurs paramètres d’excitation et d’émission pour le colorant à paroi cellulaire appliquée et d’ajuster les paramètres du système de microscopie en conséquence. Commencez l’enregistrement d’images à l’aide des paramètres précédemment ajustés et évaluez les résultats. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition d’image à la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer l’aspect de la morphogenèse de la paroi cellulaire sur qui l’expérience se concentre.
En plus de simplement visualiser les processus cellulaires, l’imagerie cellulaire en direct permet l’extraction d’informations quantitatives à partir des données enregistrées. Dans un exemple des analyses d’absorption fm 464, les échantillons fongiques sont cultivés en colonies et montés par la méthode du bloc d’agar inversé. Les analyses ont identifié des défauts dans l’organisation spatio-temporelle de l’endocytose dans la suppression de gène et les mutants sur-exprimants de gène de la protéine spécifique fongique SFP 2 de l’atroviride de trichoderma.
Des exemples de co-coloration fm 464 de protéines de fusion fluorescentes ciblées sur les compartiments endocytiques sont montrés ici. Cette co-coloration est employée pour relier la distribution subcellulaire des deux protéines fluorescentes vertes améliorées marquées protéines transmembrane, SFP 2 et GPR 1, à la voie endocytique dans l’atroviride de trichoderma. Un exemple de co-coloration fm 464 pour l’identification des différences morphogenétiques montre que cette co-coloration permet une relation supplémentaire de la dynamique de localisation subcellulaire de la protéine complexe polarisme BUD-6 étiquetée flourescently à la fin de certains processus dépendant du trafic tels que la formation de septa et la croissance polarisée de pointe hyphale.
Il caractérise également les différences dans l’organisation subcellulaire et l’architecture hyphale entre le type sauvage et les souches mutantes de neurospora crassa. La coloration représentative de la paroi cellulaire montre que les différentes propriétés d’interaction du calcofluor blanc, de la flavine solophényle et du rouge congo avec des polymères à paroi cellulaire mettent en évidence les différences morphogenétiques entre le mutant delta SFP 2 et la souche sauvage de trichoderma atroviride. L’augmentation du stress de la paroi cellulaire infligée par des concentrations élevées de colorants se produit plus rapidement et est plus prononcée chez le mutant par rapport au type sauvage.
En outre, les mêmes images permettent la quantification des différences morphogenétiques concernant le diamètre hyphal et la distance septale entre les deux souches. La surveillance représentative en temps réel de la biosynthèse des paroi cellulaires indique que la très faible concentration de blanc calcofluor empêche la saturation de la paroi cellulaire avec des molécules de colorant et permet une surveillance quantitative en temps réel de la biosynthèse des paroi cellulaires. Ceci indique que le dépôt du nouveau matériel de paroi cellulaire n’est pas uniforme, mais répond très rapidement aux contraintes physiques localisées résultant du déplacement relatif d’une cellule sur l’attachement de cellule à cellule avant la dermalinfusion dans la crassa de neurospora.
Moins, c’est plus. Utilisez le moins de colorant possible pour empêcher l’interférence du marqueur fluorescent avec les processus cellulaires. Après cette procédure, la récupération de flourescence après des expériences de photo-blanchiment a pu être exécutée pour quantifier le transport et la cinétique de biogenèse.
L’introduction pionnière de la coloration des membranes et des paroi cellulaires dans les champignons filamenteux au début du millénaire a littéralement révolutionné notre façon de voir les champignons. Calcofluor blanc peut causer des irritations oculaires et est un cancerigen classé. Congo rouge est cancérogène et tératogène, donc s’il vous plaît porter la protection des yeux et de la peau lors de la manipulation de ces teintures.
