L&#39;auteur remercie Robert Holdcraft d&#39;assistance technique. Cette étude a été financée en partie par une subvention de l&#39;USDA CSREES spéciaux (2009-34155-19957) et les fonds de trappe (NJ08192).

1. L&#39;induction locale de volatiles: les dommages herbivore <ol><li> Deux branches de plants de bleuets sont emballés avec un manchon de polyester filé. </li><li> Six chenilles spongieuse (2 e -3 e stades larvaires) sont placés à l&#39;intérieur du sac et a permis de se nourrir de plantes pour 2 jours avant la collecte volatiles. Les plantes de contrôle ne reçoivent pas de chenilles. </li><li> Émissions volatiles sont collectées que décrit ci-dessous (protocole n ° 7) au jour 3 (figure 1). Manches en polyester reste sur les végétaux pour empêcher les insectes de s&#39;échapper. </li></ol> 2. L&#39;induction locale de volatiles: les dégâts mécaniques <ol><li> Les dégâts mécaniques aux plantes sont infligées par des trous pour imiter la quantité de surface foliaire enlevé par la spongieuse. </li><li> Cinq feuilles par plante sont blessés avec deux trous de 7 mm située à la base et la partie supérieure des feuilles à la fin du jour 1 et 2. Le traitement de contrôle ne reçoit pas les dommages mécaniques. </li><liÉmissions&gt; volatils sont recueillis comme décrit ci-dessous le jour 3. </li></ol> 3. L&#39;induction locale de volatiles: MeJa <ol><li> Les plants de bleuets sont traités avec 10 ml d&#39;une solution soit 1 ou 1,5 mM d&#39;MeJa dans un 0,1% de Tween-20 solution. </li><li> MeJa est appliquée en utilisant une bouteille de 2 oz de pulvérisation. Les plantes de contrôle sont pulvérisés avec 10 ml d&#39;un 0,1% de Tween-20 solution. </li><li> Les plantes sont traitées à 16:00 h, et conservés dans la serre pendant 15 heures à l&#39;intérieur d&#39;un diamètre de 17 cm et 35 cm de haute chambre en plexiglas avant collections volatiles. </li><li> Émissions volatiles sont collectées comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. L&#39;induction systémique de volatiles: la signalisation interne <ol><li> Une branche inférieure d&#39;un plant de bleuet est ensaché avec un manchon de polyester filé et endommagé en plaçant six (2 e -3 e stades) chenilles de spongieuses l&#39;intérieur du sac. </li><li> La branche endommagé reste en dehors de la chambre de collecte des volatiles, tandis que la branches ci-dessus la branche endommagés sont placés à l&#39;intérieur de la chambre (figure 2). </li><li> Les chenilles sont autorisés à se nourrir de la branche du bas pendant 2 jours. </li><li> A partir du jour 3, les volatiles sont collectées à partir de la partie non endommagée de plantes endommagées. </li><li> Volatiles sont recueillies pendant 7 jours consécutifs. Les plantes de contrôle sont traités de façon similaire mais n&#39;a pas reçu les dommages herbivore. </li></ol> 5. Vasculaire connectivité <ol><li> Cette étude a déterminé le degré de connectivité entre les différentes branches vasculaires au sein d&#39;un plant de bleuet. </li><li> La portion d&#39;extrémité d&#39;une branche inférieure d&#39;une plante est coupée pour soutenir un pick eau florale contenant 6 ml de solution d&#39;un rhodamine B-(Sigma-Aldrich) colorant (0,25% p / v), comme décrit dans Orians et al. 11 </li><li> Mouvement de la teinture à travers la plante est contrôlée quotidiennement pendant 7 jours. </li><li> Après 7 jours, le montant de la coloration rouge est évaluée visuellement à partir de positions différentes de la plante. </li></ol> 6. L&#39;exposition à HIPVs: signalisation externe <ol><li> Branches dans une usine sont soit exposés à HIPVs partir d&#39;une branche adjacente ou reçu aucune exposition à HIPVs. </li><li> Pour exposer les branches d&#39;HIPVs, une branche inférieure est ensaché avec un manchon de polyester et de six (2 e -3 e stades) chenilles de spongieuses sont placées à l&#39;intérieur de sacs (figure 3). </li><li> L&#39;usine est mise en cage dans une chambre en plexiglas similaires à ceux décrits ci-dessus. Les insectes sont autorisés à se nourrir de plantes pour 2 jours, tels que les branches adjacentes sont exposés à volatils émis par la branche induite. </li><li> Après l&#39;exposition (jour 3), les branches exposées sont placées à l&#39;intérieur de la chambre de collecte volatile, laissant l&#39;extérieur branche insectes blessés (voir Figure 2). </li><li> Volatiles de HIPV exposés branches sont recueillies comme décrit ci-dessous, et la quantité de surface des feuilles consommées par la branche inférieure sont mesurés en utilisant Scion Image Software. </li></ol> 7. L&#39;exposition à HIPVs: l&#39;amorçage <ol><li> Afin de déterminer si les plantes sont &quot;amorcée&quot; après l&#39;exposition HIPV, les plantes sont traitées comme dans le protocole n ° 5. </li><li> La moitié des plantes sont exposées à partir d&#39;une branche HIPVs induite adjacentes, tandis que l&#39;autre moitié est exposée à des branches intactes. </li><li> Au jour 3, quatre au début 2 e stade larvaire chenilles de spongieuses sont placées sur chaque plante et les volatiles sont collectées comme décrit ci-dessous (Figure 4). </li><li> Après les collections volatiles, laisse d&#39;abord endommagé par des chenilles de la spongieuse, ainsi que ceux qui sont endommagés au jour 3, sont excisés et les quantités de surface foliaire consommée est mesurée. </li></ol> 8. Collecte des matières volatiles <ol><li> Émissions HIPV sont échantillonnées dans la serre en utilisant un système push-pull. La partie hors sol des plantes en pot (souches, branches et feuilles), y compris les chenilles dans le traitement des dommages herbivore, sont placés dans un Vola 4 Lchambre de collecte de tuiles. Une guillotine en 2 parties supporte la base des plantes. Purifié air pénètre dans le haut de chaque chambre à un débit de 2 L / min. </li><li> Volatiles sont recueillis dans des pièges remplis de 30 mg d&#39;Alltech Super-Q adsorbant en tirant d&#39;air des chambres à un taux de 1 L / min. </li><li> L&#39;appareil de collecte de volatiles se compose de quatre chambres, permettant de collections simultanées des composés volatils à partir de quatre plantes différentes (figure 1). </li><li> Les collections sont réalisées pendant la journée 9h00-17h00 h. </li><li> Après la collecte, toutes les feuilles des plantes sont récoltées, séchées au four à 60 ° C et pesés, et les chambres sont rincés à l&#39;eau du robinet et 70% d&#39;éthanol. </li></ol> 9. L&#39;analyse des composés volatils <ol><li> Les volatiles recueillies auprès de Super-Q pièges sont élués avec du dichlorométhane (150 pi) et de 400 ng de n-octane est ajoutée comme standard interne. </li><li> Séparation et quantification des composés se fait sur un Hewlett Packard 6890 SeriesChromatographe en phase gazeuse (GC) (figure 5), équipé d&#39;un détecteur à ionisation de flamme (FID) et une Agilent HP-1 colonne (10 mx 0,53 mm x 2,65 um), et il l&#39;utiliser comme gaz porteur (flux constant = 5 ml / min , vitesse = 39 cm / sec). Le programme de température a commencé à 40 ° C maintenu pendant 1 min, l&#39;augmentation à 14 ° C / min à 180 ° C (2 min), puis à 40 ° C / min à 200 ° C, et maintenu à 200 ° C pendant 2 min . </li><li> Tentative d&#39;identification des composés est réalisée sur un Varian 3400 GC couplée à un spectromètre de masse Finnigan MAT 8230 (MS), équipé d&#39;un Supelco MDN-5S colonne (30 mx 0,32 mm x 0,25 um), et avec lui comme le gaz porteur. Le MS est exploité en ionisation électronique (IE) et le total des chromatogramme ionique (TIC) en mode à 250 ° C (température de la source). Le programme a démarré à 35 ° C (1 min), a augmenté à 4 ° C / min à 170 ° C, puis à 15 ° C / min à 280 ° C. </li><li> Les composés sont identifiés provisoirement par la comparaison des données spectrales avec ceux du NIST bibliothèque et bIndice de rétention y GC, et en comparant leur temps de rétention avec ceux des composés disponibles dans le commerce. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs: Vingt-deux volatiles ont été identifiés à partir de feuilles de bleuet (figure 6). La figure 7 montre un chromatographe représentant de feuilles de bleuet en bon état ​​et les feuilles abîmées par l&#39;alimentation par la spongieuse. Les dommages mécaniques et de l&#39;alimentation par les chenilles de spongieuses augmentation des émissions de substances volatiles localement à partir de feuilles de bleuets par rapport aux témoins (figure 8). Par rapport à l&#39;alimentation chenille, le traitement induit MeJa 11 des 17 composés induits par la spongieuse (figure 9). Il y avait, cependant, aucune preuve de l&#39;induction systémique de substances volatiles des feuilles intactes de la spongieuse endommagé les plantes sept jours après les dommages alimentation initiale (à savoir, le manque de signalisation interne) (figure 10). En outre, après une semaine, très lent mouvementment du colorant rouge a été observée parmi les branches de plants de bleuets (figure 11). Il a été élevé de connectivité vasculaires parmi les feuilles dans une seule branche. Cependant, il était intermédiaire à faible connectivité entre les deux branches alignées verticalement au sein d&#39;un tournage, et la connectivité à faible entre les deux branches sur les côtés opposés d&#39;un tournage. Il n&#39;y avait aucune différence entre les montants de volatiles émises par les branches exposées à HIPVs par rapport à ceux non exposés à HIPVs (figure 12). Toutefois, HIPVs agissent comme signaux externes défensives dans les bleuets. Chenilles de spongieuses nourries sur des feuilles préalablement exposés à HIPVs consommé matériau de feuille 71% moins que ceux nourris avec des feuilles de contrôle non exposés (figure 13). Par ailleurs, des quantités de composés volatils émis par le montant de la surface foliaire consommée dans HIPV exposés branches étaient 4 fois plus élevée par rapport aux branches non exposées (figure 14), indiquant que les feuilles de HIPV ex-<html> branches posées étaient plus sensibles aux herbivores (c&#39;est à dire, ils ont été amorcées). <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Un système de push-pull est utilisé pour collecter volatiles provenant des plants de bleuets. Les plantes sont placées à l&#39;intérieur des chambres de verre et l&#39;air propre est passé sur eux. Un filtre contenant un matériau adsorbant est fixée sur le côté de chaque chambre pour volatils émis piège de l&#39;usine. Un vide est utilisée pour aspirer l&#39;air à l&#39;intérieur de la chambre à travers le filtre. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Afin d&#39;étudier la réponse systémique volatils de plants de bleuets, les branches inférieures de bleuets ont été soit endommagées par les chenilles de la spongieuse (à droite de chambre) ou à gauche intact (à gauche de chambre). Après 2 jours (le jour 3), les volatiles à partir intacts branches supérieures de plantes endommagées et non endommagées ont été recueillies. <html> ONTENU &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Pour tester si les feuilles des branches intactes répondre à HIPVs partir de branches endommagées, je ensachées l&#39;une des branches de chacun des plants de bleuets. J&#39;ai ensuite placé les chenilles spongieuse à l&#39;intérieur du sac de la moitié des plantes. Les sacs J&#39;ai utilisé permettre le mouvement de volatiles de l&#39;intérieur vers l&#39;extérieur des sacs. Les plantes ont été placées à l&#39;intérieur des chambres en plexiglas pour exposer les branches intactes au HIPVs. Volatiles ont ensuite été collectées à partir de branches exposées. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Pour tester si les feuilles de branches sont intacts &quot;amorcée&quot; après exposition à HIPVs, des expériences ont été répétées comme décrit dans la figure 3, mais les chenilles de spongieuses ont été placés sur les branches HIPV exposés et non exposés à l&#39;intérieur de chaque chambre de collecte volatiles. g &quot;alt =&quot; Figure 5 &quot;/&gt; Figure 5. Après collections volatils, les échantillons sont injectés sur un chromatographe en phase gazeuse (GC) pour identifier et quantifier les composés volatils émis par les plants de bleuets. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Au moins 22 composés sont émis à partir des feuilles de bleuet. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Figure 7. Chromatographes typiques de bleuets intacts les feuilles et les feuilles endommagées par les chenilles de la spongieuse. Volatiles sont émis à de très faibles quantités de feuilles de bleuets intacts. Toutefois, lorsque les feuilles sont endommagées par les chenilles de la spongieuse, l&#39;émission de substances volatiles ont considérablement augmenté. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig8.jpg" alt="Figure 8"/> Figure 8. Le graphique montre les quantités de chacun des 22 composés volatils émis par les feuilles intactes, mechanically endommagés par les feuilles et les feuilles endommagées par les chenilles de la spongieuse. Dommages artificielle pour imiter la quantité de surface foliaire enlevé par des chenilles accrue d&#39;émissions volatiles de feuilles de bleuet, mais la réponse a été différente de la réponse volatiles des feuilles pour nourrir la spongieuse. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig9.jpg" alt="Figure 9"/> Figure 9. Testé si la filière JA réglemente les émissions volatiles dans les feuilles de myrtille. Les plantes ont été pulvérisées avec des quantités différentes de MeJa. J&#39;ai constaté que des concentrations croissantes de manière exogène appliqué MeJa augmentation des émissions de composés volatils à partir des feuilles de bleuet. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig10.jpg" alt="Figure 10"/> Figure 10. Le graphique montre les quantités totales de substances volatiles émises par les branches de bleuets de contrôle et de branches intactes à partir de plantes spongieuse endommagé (réponse systémique). Volatiles ont été recueillies pour un auTal de 7 jours consécutifs. Je n&#39;ai pas trouvé d&#39;induction systémique de substances volatiles, même 7 jours après dommage initial à branches inférieures des plantes. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig11.jpg" alt="Figure 11"/> Figure 11. J&#39;ai utilisé la rhodamine B (colorant rouge) pour déterminer le degré de connectivité entre les branches vasculaires dans les plants de bleuets. J&#39;ai constaté que environ. 80%, 20%, 5% et 0% des feuilles des branches contenant le colorant, les branches directement au-dessus de la branche contenant le colorant, succursales à travers la branche contenant un colorant, et les agences situées dans une fusillade différentes au sein d&#39;un plant de bleuet, respectivement, ont été entièrement colorés avec le colorant. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig12.jpg" alt="Figure 12"/> Figure 12. Le graphique montre la quantité de composés volatils émis par les branches exposées à des branches HIPVs et non exposés. J&#39;ai trouvé que l&#39;exposition à HIPVs n&#39;a pas affecté les émissions volatiles dans voiennuyeuses branches de bleuets intacts. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig13.jpg" alt="Figure 13"/> Figure 13. Le graphique montre la quantité de l&#39;alimentation par des chenilles spongieuse sur les branches de bleuets exposés à des branches HIPVs et non exposés. Chenilles sur HIPV exposés branches consommé moins la quantité de feuillage comparés avec ceux sur les branches non exposées. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig14.jpg" alt="Figure 14"/> Figure 14. Quand je calcule le taux d&#39;émission par zone consommé, j&#39;ai trouvé que HIPV exposés succursales a augmenté les taux d&#39;émission de substances volatiles par rapport aux branches non exposées, indiquant que l&#39;exposition à HIPVs amorcée feuilles dans les branches de bleuets pour une réponse plus volatiles.

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	<li>Dicke, M., Van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitrophic+effects+of+herbivore-induced+plant+volatiles+in+an+evolutionary+context.">Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context.</a> Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).</li><li>Mumm, R., Dicke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+natural+plant+products+and+the+attraction+of+bodyguards+involved+in+indirect+plant+defense.">Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense.</a> Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).</li><li>Hopke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-induced+volatiles:+the+emission+of+acyclic+homoterpenes+from+leaves+of+Phaseolus+lunatus+and+Zea+mays+can+be+triggered+by+a+&#946;-glucosidase+and+jasmonic+acid.">Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a &#946;-glucosidase and jasmonic acid.</a> FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-75 (2006).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+induced+volatiles+in+the+perennial+shrub,+Vaccinium+corymbosum,+and+their+role+in+inter-branch+signaling.">Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling.</a> J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).</li><li>Karban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+resistance+in+sagebrush:+volatiles+are+key+to+intra-+and+interplant+communication.">Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication.</a> Ecology. 87, 922-922 (2006).</li><li>Frost, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signalling+by+volatiles+overcomes+vascular+constraints+on+systemic+signalling+and+primes+responses+against+herbivores.">Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores.</a> Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).</li><li>Heil, M., Bueno Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signaling+by+volatiles+leads+to+induction+and+priming+of+an+indirect+plant+defense+in+nature.">Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).</li><li>Turlings, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+herbivore-induced+plant+odors+by+host-seeking+parasitic+wasps.">Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps.</a> Science. 250, 1251-1251 (1990).</li><li>Makovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+involved+in+the+nonhost+rejection+of+Fraxinus+pennsylvanica+by+Lymantria+dispar+larvae.">Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae.</a> J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).</li></ol>

Je n&#39;ai rien à divulguer

Le push-pull appareil de collecte de volatiles décrit ici représente une méthode standard pour les collections headspace de volatiles des plantes. Cet appareil a été utilisé pour déterminer la réponse volatiles des feuilles de bleuets à l&#39;herbivorie par les chenilles spongieuse et m&#39;a aussi permis de fournir de nouvelles preuves du rôle de HIPVs dans les échanges intra-usine de signalisation. Les résultats présentés ici montrent que l&#39;alimentation chenille, exogène...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Les chambres de collecte volatils </td><td> Analytical Systems Research, Inc </td><td> VCC-G6X12DT-1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Le compresseur d&#39;air, 20 gal, sans huile, 2 hp </td><td> Ouest </td><td> 3JR71 </td><td> Vendu par Grainger, Inc </td></tr><tr><td> Système de livraison de l&#39;air </td><td> Analytical Systems Research, Inc </td><td> VCS-ADS-4AFM4C </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Système de collecte de l&#39;air </td><td> Analytical Systems Research, Inc </td><td> VCS-MVC-4CX1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Pompe à vide 100-150V, ¼ HP </td><td> Gast Manufacturing, Inc </td><td> <a href="http://www.grainger.com/Grainger/GAST-Vacuum-Pump-4F740">4F740</a> </td><td> Vendu par Grainger, Inc </td></tr><tr><td> Jasmonate de méthyle </td><td> Sigma-Aldrich &lt;/ Td&gt; <td> J2500 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93773 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Rhodamine-B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Vaporisateurs en plastique, 2 oz </td><td> Setco Inc </td><td></td><td> Cranbury, NJ </td></tr><tr><td> Manches en polyester </td><td> Opportunités Rockingham Corp </td><td></td><td> Reidsville, NC </td></tr><tr><td> Super-Q pièges collection de volatiles </td><td> Analytical Systems Research, Inc </td><td> VCT-1/4X3-SPQ </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Logiciel Scion Image </td><td> Scion Corporation </td><td></td><td> Frederick, MD </td></tr><tr><td> Dichlorométhane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Chromatographe HP 6890 </td><td> Hewlett Packard </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chromatographe en phase gazeuse Varian 3400 </td><td> Varian </td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td> n-octane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 296988 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Spectromètre de masse MAT 8230 </td><td> Finnigan </td><td></td><td> San José, Californie </td></tr><tr><td> HP-1 colonne de GC </td><td> Agilent Technologies </td><td></td><td> Palo Alto, CA </td></tr><tr><td> MDN-5S colonne de GC </td><td> Supelco, Inc </td><td></td><td> Bellefonte, PA </td></tr></table>

herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling

Volatiles des plantes induite par les Herbivores (HIPVs) sont communément émis par les plantes, après 1,2 attentat herbivore. Ces HIPVs sont principalement réglementés par l&#39;acide jasmonique hormones végétales défensives (JA) et ses dérivés méthyl jasmonate volatiles (MeJa) 3,4,5. Au cours des dernières décennies les chercheurs ont démontré que les trois HIPVs peut repousser ou attirer les herbivores, d&#39;attirer les ennemis naturels des herbivores et, dans certains cas, ils peuvent induire ou de défense des plantes Premier avant l&#39;attaque des herbivores. Dans un document récent 6, j&#39;ai signalé que l&#39;alimentation par des chenilles de la spongieuse, l&#39;application exogène Meja, et les dommages mécaniques induisent des émissions de composés volatils à partir des plants de bleuets, quoique différemment. En outre, les succursales de répondre aux bleuets HIPVs émis par les branches voisines de la même plante en augmentant les niveaux de JA et la résistance aux herbivores (c&#39;est à dire, les défenses des plantes directe), et par les émissions d&#39;amorçage volatils (ie, les défenses des plantes indirecte). Similaires à trouverIngs ont été rapportés récemment pour armoise 7, 8 peupliers, et les haricots de Lima 9 .. Ici, je décris une méthode push-pull pour la collecte de bleuets volatiles induits par des herbivores (spongieuse) l&#39;alimentation, l&#39;application exogène Meja, et les dommages mécaniques. L&#39;unité de collecte volatile compose d&#39;une chambre de 4 L de collecte volatiles, une guillotine 2-pièces, un système de livraison de l&#39;air qui purifie l&#39;air entrant, et un système d&#39;aspiration relié à un piège rempli de Super-Q adsorbant pour recueillir volatiles 5,6,10 . Volatiles recueillies en Super-Q pièges sont élués avec du dichlorométhane, puis séparés et quantifiés à l&#39;aide chromatographie en phase gazeuse (GC). Cette méthode de collecte volatile a été utilisé mon étude n 6 pour étudier la réponse volatiles de branches intactes à l&#39;exposition aux composés volatils à partir de branches endommagées par des herbivores dans les plants de bleuets. Ces méthodes sont décrites ici. Brièvement, intact branches de bleuets sont exposés à HIPVs BOFM branches voisines dans la même usine. En utilisant les mêmes techniques décrites ci-dessus, les volatiles émises par les branches après une exposition à HIPVs sont recueillies et analysées.

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Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Une méthode push-pull pour la collecte des plantes volatils est décrite. La méthode permet une comparaison des composés volatils induite par l&#39;alimentation des herbivores, le jasmonate de méthyle exogène, et les dommages mécaniques. Cette technique est également utilisée pour étudier la réponse volatiles de branches intactes à l&#39;exposition aux composés volatils à partir de branches endommagées par des herbivores dans les plants de bleuets.

Herbivores induite Volatiles Blueberry et intra-usine de signalisation

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

herbivore-induced-blueberry-volatiles-and-intra-plant-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vues.  Rutgers University. Une méthode push-pull pour la collecte des plantes volatils est décrite. La méthode permet une comparaison des composés volatils induite par l'alimentation des herbivores, le jasmonate de méthyle exogène, et les dommages mécaniques. Cette technique est également utilisée pour étudier la réponse volatiles de branches intactes à l'exposition aux composés volatils à partir de branches endommagées par des herbivores dans les plants de bleuets.

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Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

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Biologie

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocation polarisée des protéines fluorescentes dans les Xenopus</emEctoderme> en réponse à la signalisation Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Essais biologiques électroantennographique comme outil de dépistage pour les substances volatiles de la plante hôte

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

La stimulation mécanique induite par le calcium propagation des ondes dans des monocouches de cellules: l&#39;exemple de bovins cellules endothéliales de la cornée

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...