L’objectif global de cette méthodologie est d’aller au-delà de la limite optique de la plupart des cytomètres d’écoulement en permettant à un chercheur d’enregistrer cinq marqueurs supplémentaires pour interroger des populations cellulaires complexes. En utilisant cette technique, il est possible d’atteindre un immunophéotypage profond lorsque vous travaillez avec un instrument avec un faible nombre de détecteurs ou d’échantillon avec un nombre limité de cellules. Commencez cette procédure en transférant soigneusement le sang prélevé dans un tube conique de 50 millilitres.
Diluer le sang avec une quantité égale de PBS sans calcium et magnésium. Ajouter 15 millilitres de gradient de densité moyen au fond d’un nouveau tube conique de 50 millilitres. Superposez soigneusement le sang dilué sur le dessus du milieu de gradient de densité, en évitant tout mélange entre le milieu de gradient de densité et le sang dilué.
Centrifugeuse à 400 fois g pendant 30 minutes à température ambiante sans frein pour éviter la perturbation de l’interface. Après centrifugation, utiliser une pipette pour aspirer soigneusement et jeter la couche supérieure, en prêtant attention à ne pas enlever les cellules à l’interface entre le plasma et le milieu de gradient de densité. Recueillir autant de cellules mononucléaires sanguines périphériques, ou PBMCs, que possible à partir de l’interface sans toucher la pastille de globule rouge au fond du tube conique de 50 millilitres, et transférer dans un nouveau tube.
Ajouter PBS pour porter le volume final à 25 millilitres, et inverser plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, lavez les PBMCs deux fois comme indiqué dans le texte. Après avoir enlevé les plaquettes et compté les PBMCs tels que décrits dans le texte, résuspendez les cellules dans PBS, azide de sodium de 0,1% à une concentration d’une fois 10 à la septième cellule par millilitre.
Pour préparer les PBMC à la coloration, transférez 100 microlitres de chaque échantillon à une plaque v-bottom de 96 puits. Centrifuger la plaque à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
À chaque puits, ajouter 100 microlitres de PBS contenant un colorant fixable vivant/mort qui réagit avec de l’amine libre sur les protéines, et résuspendez soigneusement le mélange PBMC. Par la suite, laisser reposer la plaque pendant 10 minutes à température ambiante pour l’étiquetage des cellules mortes. Pour chaque échantillon, préparer 30 microlitres d’un mélange contenant les sept anticorps.
À ce stade, des anticorps titrés contre différentes molécules cibles et dans différents fluorochromes peuvent également être ajoutés. Centrifugez la plaque de 96 puits à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante, et aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Ajouter le cocktail d’anticorps à chaque puits, et résuspendre soigneusement sans générer de bulles.
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après 30 minutes, ajouter 150 microlitres de tampon de coloration à chaque puits, et centrifuger la plaque à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire, et résuspendez les cellules dans 200 microlitres de PBS.
Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse de cytométrie de flux. Les anticorps anti-CD3, CD8, CD14, CD19 et TCR gamma delta sont titrés avec une courbe maximale d’index de coloration. La titration des anticorps est l’étape la plus critique de ce protocole pour identifier correctement sept sous-ensembles de cellules immunitaires à l’aide de deux fluorochromes.
Pour préparer une dilution double d’anticorps, remplissez 10 puits d’une plaque de 96 puits de 40 microlitres de tampon de coloration par puits. Pour les besoins de cette vidéo, seule la titration de l’anti-CD8 sera affichée. Dans le premier puits, augmenter le volume final à 80 microlitres de tampon de coloration, et ajouter anti-CD8 à une concentration quatre fois la concentration suggérée par le fabricant.
Bien mélanger et transférer 40 microlitres au deuxième puits. Bien mélanger et répéter cette étape pour tous les autres puits. Tacher 10 échantillons de PBMCs ou de sang entier avec 30 microlitres des 10 dilutions doubles différentes d’anti-CD8 suivant le protocole démontré plus tôt.
Obtenez des données avec un cytomètre d’écoulement et tracez le signal à partir de chaque dilution. Après avoir calculé l’indice de tache pour chaque concentration d’anticorps tel que détaillé dans le texte, tracez l’indice de tache par rapport à la concentration d’anticorps exprimée en une fraction de la dilution des anticorps, et identifiez la concentration d’anticorps avec la valeur maximale de l’indice de tache. Pour titrer les anticorps anti-CD4 et anti-CD56, commencez par la stratégie de dilution double démontrée précédemment, en ajoutant des concentrations supplémentaires entre les deux pour identifier finement la plage de concentration qui permettra la séparation des lymphocytes T CD4 positifs et des cellules NK des autres populations cellulaires.
Titrer l’anticorps anti-CD4 en plaçant le signal anti-CD4 entre le double signal CD8 positif, CD3 positif et la population positive unique CD3. Titrer l’anticorps anti-CD56 suivant une stratégie similaire à la titration anticorps anti-CD4, en plaçant des cellules NK entre les populations CD3 négatives et cd3 positives. Pour commencer cette stratégie de gating à deux fluorochromes à sept marqueurs, sélectionnez la porte des lymphocytes et créez une parcelle à points avec l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole sur chaque axe.
Porte sur les lymphocytes T CD8 positifs identifiés comme cd3 et CD8 cellules doubles positives dans le coin supérieur droit de la parcelle de points. Exclure la faible population de CD8 qui pourrait contenir des cellules NKT. Porte sur les lymphocytes T CD4 positifs identifiés comme la population entre les lymphocytes T CD8 positifs et les populations positives simples de CD3.
Porte sur les cellules T du delta gamma identifiées comme étant des cellules CD3 élevées. Subdiviser les lymphocytes T gamma delta à CD8 positif et CD8 négatif. Porte sur les cellules NK identifiées comme la population entre les cellules CD3-positives et CD3-négatives.
Subdiviser les cellules NK en CD8 positif et CD8 négatif. Porte sur les cellules B identifiées comme la population CD3-négative, CD19-positive sur le coin inférieur droit de la parcelle de point. Sélectionnez la porte monocyte, et créer une parcelle de points avec l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole sur chaque axe.
Porte sur la population CD3-négative, CD14-positive. En utilisant cette stratégie, les lymphocytes d’un patient présentant le myélome multiple ont été gated sur la base de leur dispersion vers l’avant et de la dispersion latérale et de leur profil cytométrique d’écoulement. Des sous-populations de mémoire CD8-positives et des lymphocytes T naïfs ont été identifiés par l’expression de CD45RA et CCR7.
L’expression de HLA-DR et de CD57 a été employée pour étudier l’activation de cellule T dans les cellules CD8-positives naïves, mémoire, mémoire centrale, mémoire d’effecteur, et cellules CD45RA-positives de mémoire d’effecteur. De la même manière, des cellules T naïves et mémoire CD4 positives ont été identifiées. Dans la population de mémoire, CCR4 et CCR6 ont été utilisés pour identifier les sous-populations d’aide t dans les lymphocytes T CD4 positifs.
Les sous-populations de cellules NK ont été caractérisées par l’expression CD16 et CD57. Cette stratégie a été utilisée pour étudier la dynamique des populations immunitaires d’échantillons longitudinals d’un donneur dont le myélome multiple reçoit une greffe de cellules souches. La caractérisation des sous-populations de CD8 et de CD4 au fil du temps a montré une activation soutenue de cellule T CD4-positive et CD8-positive et un biaisage de l’aide de T à un phénotype de T-helper-one.
Mais au jour 60, le pourcentage de cellules B a augmenté de façon spectaculaire, prédisant la rechute du patient. La préparation appropriée de cellules et la titration d’anticorps sont des étapes critiques pour obtenir des résultats fiables utilisant cette technique. Des anticorps ciblant d’autres marqueurs peuvent être ajoutés pour effectuer une analyse plus profonde de cytométrie de flux et pour créer des panneaux cytométriques de flux modulaires ciblant plusieurs lignées en même temps.
Des approches similaires visant à augmenter le nombre de marqueurs à enregistrer pourraient également être développées à l’aide de différents ensembles de marqueurs ou pour une utilisation dans différents modèles animaux. N’oubliez pas que l’azide de sodium peut causer des brûlures à la peau et aux yeux. Par conséquent, un manteau de laboratoire, des lunettes de protection et des gants doivent toujours être portés lors de la manipulation de ce reagent.
