この方法論の全体的な目標は、研究者が複雑な細胞集団を尋問するために5つの追加マーカーを記録できるようにすることで、ほとんどの流量サイトメーターの光学限界を超えて拡大することです。この技術を使用すると、細胞数が少ない検出器やサンプルを用いて作業する際に、深い免疫型を実現することができます。50ミリリットル円錐形のチューブに慎重に引き出された血液を移すことによって、この手順を開始します。
カルシウムとマグネシウムを含まずに同量のPBSで血液を希釈します。新しい50ミリリットルの円錐管の底に15ミリリットルの密度勾配培地を加えます。密度勾配媒体の上に希釈された血液を慎重に重ね、密度勾配媒体と希釈血液との混合を避ける。
インターフェイスの中断を避けるためにブレーキなしで室温で30分間400回gで遠心分離機。遠心分離後、ピペットを使用して慎重に吸引し、上層を廃棄し、血漿と密度勾配媒体の界面で細胞を除去しないように注意してください。50ミリリットル円錐管の底にある赤い細胞ペレットに触れることなく、インターフェースからできるだけ多くの末梢血単核細胞、またはPBMCを収集し、新しいチューブに移します。
PBSを追加して最終容積を25ミリリットルにし、数回反転して混ぜます。その後、テキストに示されているとおりに PBMCs を 2 回洗浄します。テキストに記載されているように血小板を取り除き、PBMCをカウントした後、PBS中の細胞を再懸濁し、0.1%アジ化ナトリウムを10〜7番目の細胞/ミリリットルの1倍の濃度にする。
PBMCsを染色用に準備するには、各サンプルの100マイクロリットルを96ウェルVボトムプレートに移します。プレートを室温で3分間350回gで遠心分離する。細胞ペレットを邪魔することなく上清を慎重に吸引する。
各井戸に、タンパク質上の遊離アミンと反応する生きた/死んだ固定色素を含むPBSの100マイクロリットルを追加し、慎重にPBMC混合物を再中断します。続いて、プレートを室温で10分間座って死細胞の標識を行う。各サンプルに対して、7つの抗体すべてを含む混合物の30マイクロリットルを調製する。
この段階では、異なる標的分子に対する滴定抗体と異なるフッ素色クロムに対する抗体も同様に添加することができる。室温で3分間350回gの96ウェルプレートを遠心し、細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く吸引する。各ウェルに抗体カクテルを加え、気泡を発生させることなく慎重に再中断します。
暗闇の中で室温で30分間インキュベートする。30分後、各ウェルに150マイクロリットルの染色バッファーを加え、室温で3分間350回gのプレートを遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、PBSの200マイクロリットルで細胞を再懸濁する。
これで、細胞はフローサイトメトリー解析の準備が整いました。抗CD3、CD8、CD14、CD19、およびTCRガンマデルタ抗体は、最大染色インデックス曲線で滴定される。抗体滴定は、2つのフルオロクロムを使用して7つの免疫細胞サブセットを適切に同定するために、このプロトコルの中で最も重要なステップです。
2倍の抗体希釈を調製するには、96ウェルプレートの10個のウェルに40マイクロリットルの染色バッファーを充填します。このビデオの目的のために、アンチCD8の滴定のみが表示されます。最初の井戸では、最終体積を80マイクロリットルの染色バッファに増やし、メーカーが提案した濃度の4倍の濃度で抗CD8を加えます。
よく混ぜ、2番目の井戸に40マイクロリットルを移します。よく混ぜて、他のすべての井戸のためにこのステップを繰り返します。先に示したプロトコルに従って、10種類の抗CD8の30マイクロリットルのPBMCまたは全血の10サンプルを染色する。
フローサイトメーターでデータを取得し、各希釈からの信号をプロットします。各抗体濃度の染色率をテキストに詳述した後、抗体希釈の割合として表される抗体濃度に対して染色指数をプロットし、最大の染色指数値を用いて抗体の濃度を同定する。抗CD4および抗CD56抗体を評価するには、先に示した2倍希釈戦略から始め、その間に濃度を加えて、CD4陽性T細胞とNK細胞を他の細胞集団から分離できる濃度の範囲を細かく同定する。
二重CD8陽性、CD3陽性シグナルとCD3単一陽性集団との間に抗CD4シグナルを配置することにより、抗CD4抗体を活性化する。抗CD56抗体を、抗CD4抗体滴定と同様の戦略に従って、CD3陰性とCD3陽性集団の間にNK細胞を配置することにより、滴定する。この2つのフルオロクローム、7マーカーゲーティング戦略を開始するには、リンパ球ゲートを選択し、各軸上のこのプロトコルで使用される2つのフルオロクロムのうちの1つを持つドットプロットを作成します。
CD8陽性T細胞のゲートは、ドットプロットの右上隅にあるCD3およびCD8二重陽性細胞として同定された。NKT細胞を含む可能性のある薄暗いCD8集団を除外する。CD8陽性T細胞とCD3単一陽性集団との間の集団として同定されたCD4陽性T細胞上のゲート。
ガンマデルタT細胞上のゲートは、高CD3細胞として同定される。ガンマデルタT細胞をCD8陽性およびCD8陰性に細分化します。CD3陽性細胞とCD3陰性細胞の間の集団として同定されたNK細胞上のゲート。
NK細胞をCD8陽性およびCD8陰性に細分化する。ドットプロットの右下隅にCD3陰性、CD19陽性母集団として同定されたB細胞上のゲート。単球ゲートを選択し、このプロトコルで使用される2つのフルオロクロムのうちの1つを各軸に含むドットプロットを作成します。
CD3陰性、CD14陽性集団のゲート。この戦略を用いて、多発性骨髄腫患者のリンパ球は、前方散乱および側面散乱およびそれらのフローサイトメトリックプロファイルに基づいてゲートされた。CD45RAおよびCCR7の発現によりCD8陽性記憶亜集団およびナイーブT細胞を同定した。
HLA-DRおよびCD57の発現は、CD8陽性ナイーブ、メモリ、中央記憶、エフェクター記憶およびエフェクター記憶CD45RA陽性細胞におけるT細胞活性化を研究するために使用された。同様の方法で、CD4陽性ナイーブおよびメモリT細胞が同定された。CCR4とCCR6は、メモリの母集団内で、CD4陽性T細胞のTヘルパー亜集団を同定するために使用された。
NK細胞の亜集団はCD16およびCD57発現によって特徴付けられていた。この戦略は、幹細胞移植を受けた多発性骨髄腫を有するドナーからの縦方向サンプルの免疫集団のダイナミクスを調べるのに使用された。CD8およびCD4亜集団の時間の経過に関する特徴は、持続的なCD4陽性およびCD8陽性T細胞活性化とTヘルパー1表現型へのTヘルパーの歪曲を示した。
しかし、60日目に、B細胞の割合が劇的に増強され、患者の再発を予測した。適切な細胞調製および抗体滴定は、この技術を用いて信頼できる結果を達成するために重要なステップである。抗体は、他のマーカーを標的にして、より深いフローサイトメトリー分析を行い、同時に複数の系統を対象とするモジュラーフローサイトメトリクスパネルを作成することができます。
記録可能なマーカーの数を拡大することを目的とした同様のアプローチは、マーカーの異なるセットを使用して、または異なる動物モデルで使用するために開発することができます。アジ化ナトリウムは皮膚や目に火傷を引き起こす可能性があることを忘れないでください。したがって、この試薬を取り扱う際には、ラボコート、保護眼鏡、手袋を着用する必要があります。
