이 방법론의 전반적인 목표는 연구원이 복잡한 세포 집단을 심문하기 위하여 5개의 추가 마커를 기록할 수 있게 함으로써 대부분의 유량 세포계의 광학 한계를 넘어 확장하는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 제한된 수의 세포로 검출기 또는 샘플의 낮은 수와 기기로 작업 할 때 깊은 면역 페노티핑을 달성 할 수있다. 그려진 혈액을 50밀리리터 원내 튜브로 조심스럽게 이송하여 이 절차를 시작합니다.
칼슘과 마그네슘없이 PBS의 동일한 금액으로 혈액을 희석. 새로운 50밀리리터 원판 튜브의 바닥에 밀도 그라데이션 배지 15밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션 배지 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 오버레이하여 밀도 그라데이션 배지와 희석된 혈액 간의 혼합을 피합니다.
원심분리기는 실온에서 30분 동안 400배 g의 원심분리기로, 브레이크없이 인터페이스의 중단을 방지합니다. 원심분리 후 파이펫을 사용하여 상층을 조심스럽게 흡인하고 폐기하여 플라즈마와 밀도 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 세포를 제거하지 않도록 주의를 기울입니다. 50밀리리터 원핵튜브의 바닥에 있는 적혈구 펠릿을 만지지 않고 인터페이스로부터 가능한 한 많은 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC를 수집하고 새로운 튜브로 이송한다.
PBS를 추가하여 최종 볼륨을 25 밀리리터에 가져오고 여러 번 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 텍스트에 표시된 대로 PBMC를 두 번 세척합니다. 혈소판을 제거하고 텍스트에 설명된 바와 같이 PBMC를 계수한 후, PBS에서 세포를 재연한 후, 0.1%의 나트륨 아지드를 밀리리터당 7번째 세포에 1회 10분의 1의 농도로 재보페팅한다.
염색을 위해 PBMC를 준비하려면 각 샘플의 100 마이크로리터를 96웰 V-바닥 플레이트로 전송합니다. 상온에서 3분 동안 350배g의 접시를 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다.
각 우물에, 단백질에 무료 아민과 반응하는 라이브 / 죽은 고정 염료를 포함하는 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 신중하게 PBMC 혼합물을 다시 중단. 그 후, 플레이트가 죽은 세포의 라벨링을 위해 실온에서 10 분 동안 앉을 수 있도록하십시오. 각 샘플에 대해, 모든 7개의 항체를 포함하는 혼합의 30 마이크로리터를 준비합니다.
이 단계에서, 다른 표적 분자및 다른 형광에 대하여 적정항체는 또한 추가할 수 있습니다. 실온에서 3분 동안 96웰 플레이트를 350배g에서 원심분리하고 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 항체 칵테일을 각 웰에 넣고 거품을 일으키지 않고 조심스럽게 다시 일시 중지합니다.
어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 30분 후 각 웰에 150마이크로리터의 염색 버퍼를 추가하고 실온에서 3분 동안 350배의 플레이트를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시키고 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 재보힙합니다.
세포는 이제 유동 세포 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 안티 CD3, CD8, CD14, CD19 및 TCR 감마 델타 항체는 최대 염색 지수 곡선으로 적정화된다. 항체 적정은 2개의 불소크롬을 사용하여 7개의 면역 세포 서브세트를 제대로 확인하기 위하여 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.
2배 의 항체 희석을 준비하려면 96웰 플레이트 의 10웰을 우물당 40 마이크로리터의 염색 버퍼로 채웁니다. 이 비디오의 목적을 위해 안티 CD8의 적정만 표시됩니다. 첫 번째 우물에서는 최종 부피를 염색 버퍼의 80 마이크로리터로 늘리고 제조업체가 제안한 농도의 4배 의 농도로 안티 CD8을 첨가한다.
잘 섞어서 40마이크로리터를 두 번째로 잘 옮기. 잘 섞어서 다른 모든 우물에 대해이 단계를 반복하십시오. 이전에 입증된 프로토콜에 따라 10개의 다른 2배 희석제 중 30개의 마이크로리터를 가진 PBMC 또는 전혈의 스테인 10 샘플.
유동 사이토미터로 데이터를 획득하고 각 희석으로부터 신호를 플롯합니다. 각 항체 농도에 대한 얼룩 지수를 산출한 후, 항체 희석의 일부로 발현된 항체 농도 대 얼룩 지수를 플롯하고, 최대 얼룩 지수 값을 가진 항체의 농도를 식별한다. 반대로 CD4 및 반대로 CD56 항체를 적재하기 위하여는, 이전에 입증된 2배 희석 전략으로 시작하여, 다른 세포 집단으로부터 CD4 양성 T 세포 및 NK 세포의 분리를 허용할 농도의 범위를 미세하게 식별하기 위해 그 사이에 추가 농도를 추가한다.
이중 CD8 양성, CD3 양성 신호 및 CD3 단일 양성 집단 사이에 안티 CD4 신호를 배치하여 안티 CD4 항체를 적시한다. CD3-음수 및 CD3 양성 집단 사이에 NK 세포를 배치함으로써, 안티 CD4 항체 적정과 유사한 전략을 따르는 항 CD56 항체를 적티레이. 이 두 불소, 7 마커 게이팅 전략을 시작하려면 림프구 게이트를 선택하고 각 축에서이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오로크롬 중 하나와 함께 점 플롯을 만듭니다.
CD8 양성 T 세포의 게이트는 점 플롯의 오른쪽 상단에 있는 CD3 및 CD8 이중 양성 셀로 확인되었습니다. NKT 셀을 포함할 수 있는 희미한 CD8 인구를 제외합니다. CD8 양성 T 세포와 CD3 단일 양성 집단 사이의 인구로 확인된 CD4 양성 T 세포의 게이트.
높은 CD3 세포로 확인된 감마 델타 T 세포의 게이트. 감마 델타 T 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. CD3 양성 및 CD3 음성 세포 사이의 인구로 확인된 NK 세포의 게이트.
NK 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. 점 플롯의 오른쪽 하단모서리에 있는 CD3-음수, CD19 양성 집단으로 확인된 B 세포의 게이트. 단두구 게이트를 선택하고 각 축에서 이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오크롬 중 하나를 사용하여 도트 플롯을 만듭니다.
CD3-음수, CD14 양성 모집단의 게이트입니다. 이 전략을 사용하여 다발성 골수종을 가진 환자의 림프구는 전방 산란 및 측면 분산 및 유동 세포 측정 프로파일에 기초하여 문이 되었습니다. CD8 양성 메모리 하위 집단 및 순진한 T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현에 의해 확인되었다.
HLA-DR 및 CD57의 발현은 CD8 양성 순진한, 메모리, 중앙 메모리, 이펙터 메모리 및 이펙터 메모리 CD45RA 양성 세포에서 T 세포 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다. 유사한 방식으로, CD4 양성 순진한 기억 및 메모리 T 세포가 확인되었다. 메모리 집단 내에서 CCR4 및 CCR6는 CD4 양성 T 세포에서 T 도우미 하위 집단을 식별하는 데 사용되었습니다.
NK 세포의 하위 집단은 CD16 및 CD57 발현을 특징으로 하였다. 이 전략은 줄기 세포 이식을 수신하는 다발성 골수종을 가진 기증자에게서 세로 견본의 면역 집단에 있는 역학을 조사하기 위하여 이용되었습니다. 시간이 지남에 따라 CD8 및 CD4 하위 집단의 특성화는 지속적인 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 활성화 및 T 도우미-1 표현형에 T 도우미의 왜곡을 보였다.
그러나 60일째에, B 세포의 백분율은 극적으로 증강되어 환자 재발을 예측했습니다. 적절한 세포 제제 및 항체 적정은 이 기술을 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 달성하기 위한 중요한 단계이다. 다른 마커를 표적으로 하는 항체는 더 깊은 유동 세포측정 분석을 달성하고 동시에 여러 혈통을 표적으로 하는 모듈형 흐름 세포 측정 패널을 생성하기 위하여 추가될 수 있습니다.
기록 가능한 마커의 수를 확대하기위한 유사한 접근 법은 다양한 마커 세트를 사용하거나 다른 동물 모델에서 사용하기 위해 개발 될 수 있습니다. 아지드 나트륨이 피부와 눈에 화상을 입을 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 이 시약을 취급할 때는 실험실 코트, 보호 안경 및 장갑을 착용해야 합니다.
