الهدف العام لهذه المنهجية هو توسيع نطاق ما هو أبعد من الحد البصري لمعظم أجهزة قياس التدفق من خلال السماح للباحث بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب مجموعات الخلايا المعقدة. باستخدام هذه التقنية ، من الممكن تحقيق مناعي عميق عند العمل مع جهاز مع عدد قليل من أجهزة الكشف أو عينة مع عدد محدود من الخلايا. ابدأ هذا الإجراء عن طريق نقل الدم المسحوب بعناية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
تمييع الدم مع كمية مساوية من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 15 ملليلتر من كثافة المتوسطة التدرج إلى أسفل أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. تراكب بعناية الدم المخفف على رأس متوسط التدرج الكثافة، وتجنب أي خلط بين متوسط التدرج الكثافة والدم المخفف.
أجهزة الطرد المركزي عند 400 مرة ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل لتجنب تعطيل واجهة. بعد الطرد المركزي، استخدم ماصة لpirate بعناية وتجاهل الطبقة العليا، مع إيلاء الاهتمام لعدم إزالة الخلايا في واجهة بين البلازما وكثافة المتوسط التدرج. جمع العديد من خلايا الدم أحادية النوى الطرفية، أو PBMCs، ممكن من واجهة دون لمس بيليه الخلية الحمراء في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، ونقلها إلى أنبوب جديد.
إضافة برنامج تلفزيوني لتحقيق حجم النهائي إلى 25 ملليلتر، وعكس عدة مرات لخلط. ثم، قم بغسل PBMCs مرتين كما هو مشار إليه في النص. بعد إزالة الصفائح الدموية والعد PBMCs كما هو موضح في النص، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ أزيميد الصوديوم إلى تركيز واحد مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.
لإعداد PBMCs لتلطيخ، نقل 100 ميكرولترات من كل عينة إلى 96 بئر V-أسفل لوحة. الطرد المركزي لوحة في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. pirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية.
إلى كل بئر، إضافة 100 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني تحتوي على صبغة حية / ميتة قابلة للإصلاح التي تتفاعل مع أمين الحرة على البروتينات، وإعادة تثبيت خليط PBMC بعناية. في وقت لاحق، والسماح لوحة للجلوس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لوضع العلامات من الخلايا الميتة. لكل عينة، إعداد 30 ميكرولترات من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة السبعة.
في هذه المرحلة، يمكن إضافة الأجسام المضادة المعايرة ضد جزيئات مستهدفة مختلفة وفي الفلوروكرومات المختلفة أيضا. الطرد المركزي لوحة 96-جيدا في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، وpirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل بئر، و resuspend بعناية دون توليد فقاعات.
احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد 30 دقيقة، إضافة 150 ميكرولترات من ضوء البقع العازلة إلى كل بئر، والطرد المركزي لوحة في 350 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطامح بعناية عظمى دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
الخلايا جاهزة الآن لتحليل تدفق الخلايا. يتم معاير الأجسام المضادة لـ ANTI DELTA ANTI-CD3 و CD8 و CD14 و TCR delta مع الحد الأقصى لمنحنى مؤشر البقع. تعدّل الجسم المضاد هي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول لتحديد سبع مجموعات فرعية من الخلايا المناعية باستخدام اثنين من الفلوروكررومات بشكل صحيح.
لإعداد تخفيف الأجسام المضادة ذات شقين ، تعبئة 10 آبار من لوحة 96-well مع 40 ميكرولترات من عازلة تلطيخ في البئر. لأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض المعايرة المضادة لـ CD8 فقط. في البئر الأول، زيادة حجم النهائي إلى 80 ميكرولترات من المخزن المؤقت تلطيخ، وإضافة المضادة ل-CD8 بتركيز أربعة أضعاف التركيز المقترح من قبل الشركة المصنعة.
تخلط جيدا ونقل 40 ميكرولترات إلى البئر الثانية. تخلط جيدا وكرر هذه الخطوة لجميع الآبار الأخرى. وصمة 10 عينات من PBMCs أو الدم كله مع 30 ميكرولترات من 10 مختلفة اثنين أضعاف التخفيف من CD8 المضادة بعد البروتوكول أظهرت في وقت سابق.
الحصول على البيانات مع جهاز قياس التدفق، ومؤامرة إشارة من كل تخفيف. بعد حساب مؤشر وصمة عار لكل تركيز الأجسام المضادة كما هو مفصل في النص، رسم مؤشر وصمة عار مقابل تركيز الأجسام المضادة أعرب عن جزء من تخفيف الأجسام المضادة، وتحديد تركيز الأجسام المضادة مع الحد الأقصى لقيمة مؤشر وصمة عار. لتماهي الأجسام المضادة CD4 وC56 المضادة، تبدأ مع استراتيجية التخفيف ذات شقين أظهرت في وقت سابق، إضافة تركيزات إضافية بين لتحديد بدقة نطاق التركيز الذي سيسمح فصل الخلايا T CD4 إيجابية وخلايا NK من مجموعات الخلايا الأخرى.
Titrate الأجسام المضادة لـ CD4 بوضع إشارة CD4 المضادة بين إشارة CD8-positive مزدوجة، CD3-positive وSD3- السكان إيجابية واحدة. تماثل الجسم المضاد لـ CD56 باتباع استراتيجية مشابهة لتكميل الأجسام المضادة لـ CD4 ، عن طريق وضع خلايا NK بين الخلايا CD3-negative وSD3-positives. لبدء هذه الفلوروكروم، سبعة علامة اتّباع الغات، حدد بوابة الخلايا اللمفاوية، وإنشاء مؤامرة نقطة مع واحدة من الفلوروكررومات اثنين المستخدمة في هذا البروتوكول على كل محور.
بوابة على CD8 إيجابية الخلايا T التي تم تحديدها كD3 و CD8 الخلايا الإيجابية المزدوجة في الزاوية اليمنى العليا من مؤامرة نقطة. استبعاد عدد الفئات الخافتة CD8 التي قد تحتوي على خلايا NKT. بوابة على CD4 إيجابية الخلايا التائية التي تم تحديدها على أنها السكان بين الخلايا T CD8 إيجابية وSD3 السكان إيجابية واحدة.
بوابة على خلايا T دلتا غاما التي تم تحديدها كخلايا CD3 عالية. تقسيم الخلايا التائية دلتا غاما إلى CD8 إيجابية وD8 السلبية. بوابة على خلايا NK التي تم تحديدها على أنها مجموعة السكان بين الخلايا CD3-positive-positive وD3-سالبة.
تقسيم الخلايا NK إلى CD8 إيجابية و CD8 السلبية. بوابة على الخلايا B التي تم تحديدها على أنها مجموعة مضغوطة CD3، إيجابية CD19 في الزاوية اليمنى السفلى من مؤامرة نقطة. حدد بوابة أحادية، وقم بإنشاء رسم نقطة مع أحد الفلوروكرومات المُستخدمين في هذا البروتوكول على كل محور.
بوابة على CD3 السلبية، CD14-positive السكان. باستخدام هذه الاستراتيجية، تم اسور الخلايا الليمفاوية من مريض مصاب بالورم النخاعي المتعدد على أساس مبعثرها إلى الأمام ومبعثر الجانب وتدفقها الملف السيتومتري. تم تحديد الخلايا الفرعية للذاكرة المدمجة في CD8 والخلايا التائية الساذجة من خلال التعبير عن CD45RA و CCR7.
تم استخدام التعبير عن HLA-DR و CD57 لدراسة تنشيط الخلية T في CD8-positive السذاجة والذاكرة والذاكرة المركزية، وذاكرة التأثير، وذاكرة CD45RA إيجابية. وبطريقة مماثلة، تم تحديد الخلايا السذاجة والذاكرة T CD4 الإيجابية. ضمن الذاكرة السكانية، CCR4 وCCR6 واستخدمت لتحديد السكان الفرعية T مساعد في خلايا T إيجابية CD4.
وتتميز الاكتظاظ الفرعي لخلايا NK بتعبير CD16 و CD57. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية للتحقيق في ديناميات في مجموعات المناعة من العينات الطولية من متبرع مع المايلوما متعددة تلقي زرع الخلايا الجذعية. وصف لC8 و CD4 الاكتظاظ الفرعي مع مرور الوقت أظهرت CD4 المستمرة إيجابية و CD8-positive T خلية التنشيط وانحراف T المساعد إلى النمط الظاهري T-helper-one.
ولكن في اليوم 60 ، زادت النسبة المئوية للخلايا B بشكل كبير ، مما توقع الانتكاس المريض. إعداد الخلايا المناسبة و معايرة الأجسام المضادة هي خطوات حاسمة لتحقيق نتائج موثوقة باستخدام هذه التقنية. يمكن إضافة الأجسام المضادة التي تستهدف علامات أخرى لإنجاز تحليل أعمق لقياس التدفق وإنشاء لوحات cytometric للتدفق المعياري تستهدف العديد من الفئات في نفس الوقت.
ويمكن أيضاً وضع نُهج مماثلة ترمي إلى توسيع عدد العلامات القابلة للتسجيل باستخدام مجموعات مختلفة من العلامات أو لاستخدامها في نماذج حيوانية مختلفة. لا ننسى أن أزيد الصوديوم يمكن أن يسبب حروقا للجلد والعينين. لذلك، ينبغي دائما ارتداء معطف المختبر، والنظارات الواقية، والقفازات عند التعامل مع هذا الكاشف.
