Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, über die optische Grenze der meisten Durchflusszytometer hinaus zu expandieren, indem es einem Forscher ermöglicht wird, fünf zusätzliche Marker aufzuzeichnen, um komplexe Zellpopulationen zu hinterhören. Mit dieser Technik ist es möglich, eine tiefe Immunophenotypisierung zu erreichen, wenn man mit einem Instrument mit einer geringen Anzahl von Detektoren oder Proben mit begrenzter Anzahl von Zellen arbeitet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie gezogenes Blut sorgfältig in eine 50-Milliliter-Konustube übertragen.
Das Blut mit einer gleichen Menge PBS ohne Kalzium und Magnesium verdünnen. Fügen Sie 15 Milliliter DichteGradient mittel an den Boden eines neuen 50-Milliliter konischen Rohrs hinzu. Überlagern Sie vorsichtig das verdünnte Blut über dem Dichtegradientenmedium, wodurch eine Vermischung zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem verdünnten Blut vermieden wird.
Zentrifuge bei 400 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse, um Störungen der Schnittstelle zu vermeiden. Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine Pipette, um die obere Schicht sorgfältig zu aspirieren und zu verwerfen, wobei darauf zu achten ist, dass Zellen an der Schnittstelle zwischen Plasma- und Dichtegradientenmedium nicht entfernt werden. Sammeln Sie so viele periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMCs wie möglich von der Schnittstelle, ohne das rote Zellpellet an der Unterseite des 50-Milliliter-Konischen Rohrs zu berühren, und übertragen Sie es in ein neues Rohr.
Fügen Sie PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf 25 Milliliter zu bringen, und invertieren Sie mehrmals, um es zu mischen. Waschen Sie dann die PBMCs doppelt wie im Text angegeben. Nach dem Entfernen der Thrombozyten und zählen die PBMCs, wie im Text beschrieben, setzen Sie die Zellen in PBS, 0,1% Natriumazid auf eine Konzentration von ein mal 10 bis die siebte Zelle pro Milliliter.
Um die PBMCs für die Färbung vorzubereiten, übertragen Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf eine 96-Well-V-Bodenplatte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 350 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören.
Zu jedem Brunnen, fügen Sie 100 Mikroliter PBS mit einem lebenden / toten fixierbaren Farbstoff, der mit freiem Amin auf Proteine reagiert, und setzen Sie die PBMC-Mischung sorgfältig aus. Anschließend lassen Sie die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur für die Kennzeichnung von abgestorbenen Zellen sitzen. Für jede Probe 30 Mikroliter einer Mischung vorbereiten, die alle sieben Antikörper enthält.
In diesem Stadium können auch titrierte Antikörper gegen verschiedene Zielmoleküle und in verschiedenen Fluorchromen hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 350-fachem g für drei Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie den Antikörper-Cocktail zu jedem Brunnen hinzu und setzen Sie ihn sorgfältig wieder aus, ohne Blasen zu erzeugen.
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach 30 Minuten 150 Mikroliter Färbepuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte bei Raumtemperatur drei Minuten lang 350 mal g zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören, und die Zellen in 200 Mikroliter PBS wieder aussetzen.
Die Zellen sind nun bereit für die Analyse der Durchflusszytometrie. Anti-CD3-, CD8-, CD14-, CD19- und TCR-Gammadelta-Antikörper werden mit einer maximalen Färbeindexkurve titriert. Die Antikörpertitration ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll, um sieben Immunzellen-Submenge mit zwei Fluorchromen richtig zu identifizieren.
Um eine zweifache Antikörperverdünnung vorzubereiten, füllen Sie 10 Brunnen einer 96-Well-Platte mit 40 Mikroliter Neinen Färbepuffer pro Brunnen. Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Titration von Anti-CD8 angezeigt. Erhöhen Sie im ersten Brunnen das Endvolumen auf 80 Mikroliter Färbepuffer, und fügen Sie Anti-CD8 in einer Konzentration hinzu, die viermal so hoch ist wie der Hersteller.
Gut mischen und 40 Mikroliter auf den zweiten Brunnen übertragen. Mischen Sie gut und wiederholen Sie diesen Schritt für alle anderen Brunnen. Stain 10 Proben von PBMCs oder Vollblut mit 30 Mikroliter der 10 verschiedenen zweifachen Verdünnungen von Anti-CD8 nach dem Zuvor gezeigten Protokoll.
Erfassen Sie Daten mit einem Durchflusszytometer, und zeichnen Sie das Signal aus jeder Verdünnung. Nach der Berechnung des Fleckenindex für jede Antikörperkonzentration, wie im Text beschrieben, zeichnen Sie den Fleckenindex im Vergleich zur Antikörperkonzentration, ausgedrückt als Bruchteil der Antikörperverdünnung, und identifizieren Sie die Konzentration des Antikörpers mit dem maximalen Fleckenindexwert. Um die Anti-CD4- und Anti-CD56-Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der zuvor gezeigten zweifachen Verdünnungsstrategie, indem sie zusätzliche Konzentrationen dazwischen hinzufügt, um den Konzentrationsbereich, der eine Trennung von CD4-positiven T-Zellen und NK-Zellen von den anderen Zellpopulationen ermöglicht, fein zu identifizieren.
Titrate den Anti-CD4-Antikörper, indem das Anti-CD4-Signal zwischen dem Doppel-CD8-positiven, CD3-positiven Signal und der CD3-Einzel-positiven Population platziert wird. Titrate den Anti-CD56-Antikörper nach einer Strategie ähnlich der Anti-CD4-Antikörpertitration, indem NK-Zellen zwischen den CD3-negativen und den CD3-positiven Populationen platziert werden. Um diese Zwei-Fluorchrome-, Sieben-Marker-Gating-Strategie zu beginnen, wählen Sie das Lymphozytentor aus, und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem der beiden Fluorchrome, die in diesem Protokoll auf jeder Achse verwendet werden.
Gate auf CD8-positiven T-Zellen, die als CD3- und CD8-Doppel-Positive-Zellen in der oberen rechten Ecke des Punktdiagramms identifiziert wurden. Schließen Sie die dim CD8-Population aus, die NKT-Zellen enthalten könnte. Gate auf CD4-positiven T-Zellen identifiziert als die Population zwischen CD8-positive T-Zellen und die CD3 einzelne positive Populationen.
Gate auf Gamma-Delta-T-Zellen, die als hohe CD3-Zellen identifiziert wurden. Unterteilen Sie Gamma-Delta-T-Zellen in CD8-positiv und CD8-negativ. Gate auf NK-Zellen identifiziert als die Population zwischen CD3-positive und CD3-negative Zellen.
Unterteilen Sie die NK-Zellen in CD8-positiv und CD8-negativ. Gate auf B-Zellen, die als CD3-negative, CD19-positive Population in der unteren rechten Ecke des Punktdiagramms identifiziert wurden. Wählen Sie das Monozytentor aus, und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem der beiden Fluorchrome, die in diesem Protokoll auf jeder Achse verwendet werden.
Gate auf der CD3-negativen, CD14-positiven Population. Mit dieser Strategie wurden Lymphozyten eines Patienten mit multiplem Myelom auf der Grundlage ihrer Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung und ihres zytometrischen Flussprofils abgegrenzt. CD8-positive Speichersubpopulationen und naive T-Zellen wurden durch die Expression von CD45RA und CCR7 identifiziert.
Expression von HLA-DR und CD57 wurde verwendet, um T-Zell-Aktivierung in CD8-positive naive, Speicher, zentralem Speicher, Effektorspeicher und Effektorspeicher CD45RA-positive Zellen zu untersuchen. In ähnlicher Weise wurden CD4-positive naive und Speicher-T-Zellen identifiziert. Innerhalb der Speicherpopulation wurden CCR4 und CCR6 verwendet, um T-Helfer-Subpopulationen in CD4-positiven T-Zellen zu identifizieren.
Subpopulationen von NK-Zellen wurden durch CD16- und CD57-Expression charakterisiert. Diese Strategie wurde verwendet, um die Dynamik in Immunpopulationen von Längsproben von einem Spender mit multiplem Myelom zu untersuchen, der eine Stammzelltransplantation erhält. Die Charakterisierung von CD8- und CD4-Subpopulationen im Laufe der Zeit zeigte eine anhaltende CD4-positive und CD8-positive T-Zellaktivierung und eine Neigung des T-Helfers zu einem T-Helfer-eins-Phänotyp.
Aber am 60. Tag erhöhte sich der Prozentsatz der B-Zellen dramatisch und prognostizierte den Patienten-Rückfall. Richtige Zellvorbereitung und Antikörpertitration sind wichtige Schritte, um zuverlässige Ergebnisse mit dieser Technik zu erzielen. Antikörper, die auf andere Marker abzielen, können hinzugefügt werden, um eine tiefere Flusszytometrieanalyse durchzuführen und modulare zytometrische Durchflusspanels zu erstellen, die mehrere Linien gleichzeitig ansprechen.
Ähnliche Ansätze zur Erweiterung der Anzahl der beschreibbaren Marker könnten auch mit unterschiedlichen Markersätzen oder für den Einsatz in verschiedenen Tiermodellen entwickelt werden. Vergessen Sie nicht, dass Natriumazid Verbrennungen an Haut und Augen verursachen kann. Daher sollten bei der Handhabung dieses Reagenzes immer ein Labormantel, eine Schutzbrille und Handschuhe getragen werden.
