La capacité d’acquérir de grandes quantités de données à partir d’expériences d’imagerie calcique s’est considérablement améliorée, en particulier avec des expériences d’imagerie tissulaire. Nos protocoles décrivent les techniques d’analyse appropriées pour quantifier et décrire ces ensembles de données. Nos protocoles génèrent une gamme de valeurs spatiales, temporelles et d’intensité qui sont intrinsèques à la signalisation du calcium dans des tissus entiers et qui peuvent être perdues dans une analyse plus rudimentaire.
Une heure avant le transfert d’imagerie d’un intestin grêle récolté à partir d’une souris avec des cellules interstitielles de Cajal ou ICC qui expriment spécifiquement un indicateur de calcium génétiquement codé au stade d’un microscope confocal de disque de filature. Et infuser continuellement le tissu avec 37 degrés Celsius Krebs-Ringer bicarbonate ou KRB solution. À l’aide d’un grossissement de 60 à 100 X, localisez le plexus myenterique en forme de stellate ICC ou ICC-MY entre les couches musculaires lisses circulaires et longitudinales de l’intestin grêle.
Ensuite, localisez le plexus musculaire profond en forme de fuseau ICC ou ICC-DMP dans un seul plan entre la couche musculaire lisse circulaire et le plexus submucosal et enregistrez les films comme une pile d’images du TIFF. Pour créer des cartes spatiotemporales ou des MS de l’activité calcium ICC-DMP, ouvrez la pile d’images dans ImageJ, et cliquez sur Image, Type et 32 bits pour modifier la qualité de l’image. Pour créer un clic droit de balayage en ligne sur l’outil de sélection des lignes et sélectionnez la ligne segmentée.
À l’aide de clics simples à gauche tracer une ligne le long de l’accès moyen d’un ICC-DMP individuel, en cliquant en double lorsque l’ensemble de la cellule a été décrite. Sélectionnez Image, Piles et Reslice. Une fenêtre contextée apparaîtra.
Sélectionnez Tournez à 90 degrés pour orienter l’analyse de la ligne de gauche à droite afin qu’elle puisse être calibrée et lue contre le temps sur l’axe x avec de l’espace sur l’axe y et cliquez sur OK. La carte spatiotemporal apparaîtra. Pour mesurer avec précision l’amplitude des signaux calciques de la carte, sélectionnez la sélection rectangulaire et dessinez une région d’intérêt autour de la zone de la STM qui affiche la zone de fluorescence la plus uniforme et la moins intense. Cliquez sur Analyser et Histogramme pour obtenir une valeur moyenne de l’intensité dans la région sélectionnée d’intérêt et cliquez sur Modifier, Sélectionner, Sélectionner tous pour sélectionner l’ensemble de la STM.
Ensuite, cliquez sur Processus, Mathématiques et Diviser et entrez la valeur moyenne de l’intensité avec la région STM sélectionnée d’intérêt dans la boîte pop-up. La STM deviendra noire. Corrigez cela en cliquant sur Image, Ajustez, Luminosité/Contraste et Auto dans la fenêtre pop-up.
L’analyse en ligne sera maintenant calibrée pour l’amplitude avec l’intensité de la fluorescence exprimée sous forme de fluorescence divisée par la fluorescence zéro. La STM affichera le nombre d’images dans la pile TIFF sur l’axe x et le nombre de pixels représentant la longueur de la cellule sur l’axe y. Pour quantifier les données temporelles et spatiales des signaux de calcium cliquez sur Image et Propriétés et entrez les valeurs appropriées pour calibrer complètement la STM pour l’espace et le temps dans la fenêtre contexturée.
Pour analyser les différents événements calcique, cliquez sur Straight Line et cliquez et faites glisser sur la STM pour tracer une ligne horizontale droite à travers le centre d’un événement calcium parallèle à l’axe x. Cliquez ensuite analyser et tracer le profil. Une boîte apparaîtra montrant le profil de l’intrigue de l’événement calcium.
Pour l’analyse basée sur les particules des données de signalisation de calcium ICC-MY, ouvrez le fichier de film en volume et cliquez à droite pour sélectionner filtre STK, Différenciez-vous. Cliquez à nouveau à droite pour saisir une valeur à différencier. Appuyez sur Entrez et cliquez à gauche pour initier la différenciation.
Pour créer des particules, utilisez le bouton de la souris moyenne pour faire défiler le film pour sélectionner une section de 20 à 40 images qui comprend une période de quiescent, suivie de l’apparition d’un cluster transitoire en calcium et de 20 à 40 images qui suivent juste après l’amas. Lorsque tous les cadres ont été sélectionnés en clic droit dans la fenêtre du film pour accéder aux informations sur les particules STK OPS Ramp DS et cliquez pour exécuter une routine d’analyse des particules qui accélère progressivement le seuil du maximum à l’intensité minimale. Pour assurer une analyse réussie des particules, assurez-vous d’incorporer autant de non-activité transitoire avant le calcium et autant de non-activité transitoire post-calcium que vous le pouvez.
Cela aidera à augmenter le rapport signal-bruit. L’analyse sera affichée graphiquement dans la fenêtre de l’intrigue comme parcelle de bruit et dans la fenêtre de traces comme trois traces de couleur avec la trace verte représentant le nombre de particules, la trace rouge représentant la taille moyenne des particules, et la trace bleue représentant le seuil d’intensité absolue. Pour équilibrer l’histogramme, l’intrigue du bruit des particules presse H sur le clavier.
Ensuite, appuyez sur la touche support droit pour cycle à travers les schémas de couleurs jusqu’à ce que l’arrière-plan est blanc avec les traces de couleur sur le dessus. Appuyez une fois sur F sur le clavier pour mettre en place un outil de mesure. Appuyez ensuite sur F une deuxième fois pour marquer une seule ligne verticale dans la barre de défilement de la fenêtre de traces sur la parcelle à l’intersection où les parcelles colorées commencent à se déplacer vers le côté droit.
Dans la fenêtre de traces, utilisez le bouton de la souris moyenne pour faire défiler du point d’inflexion de la trace rouge à la ligne verticale blanche marquée. Après avoir noté la moyenne Y affichée, cliquez à nouveau sur le bouton de la souris du milieu à l’intérieur de la fenêtre des traces pour désélectionner la trace bleue. Dans la fenêtre de film cliquez sur C pour faire monter une roue de couleur, et D pour ajuster le seuil.
Les particules valides seront désormais affichées en rouge, et celles qui saturent seront blanches. Utilisez le bouton de la souris gauche pour faire défiler jusqu’à ce que les zones blanches soient enlevées et utilisez le bouton de la souris moyenne pour ajuster la valeur numérique jaune de la roue de couleur à la valeur moyenne Y pour attribuer tout en rouge comme particule transitoire active de calcium au seuil déterminé. Pour enregistrer les données en tant que fichier de particules basé sur la coordination, cliquez à droite pour accéder à STK 3D, économisez la particule zéro et cliquez à gauche pour enregistrer le fichier.
Pour créer des cartes de chaleur d’activité des particules, ouvrez le fichier de particules enregistré et cliquez à droite dans la fenêtre du film pour accéder aux particules STKops, StatMap Flag et saisir les affectations de drapeau à analyser. Cliquez pour appliquer l’analyse et une carte thermique montrant le total des particules pour toute la durée de l’enregistrement avec différentes couleurs représentant le pourcentage d’occurrence tout au long de l’enregistrement. Cliquez à droite pour enregistrer la carte thermique en tant que fichier TIFF.
Puis cliquez à droite dans la fenêtre du film pour accéder à la mesure des particules, stats de particules STK égale, et entrez une affectation de drapeau pour l’analyse. Une série de traces seront générées dans la fenêtre de trace. L’analyse de la STM permet de surveiller et d’enregistrer les caractéristiques spatiales de la signalisation du calcium, comme la propagation spatiale et la vitesse de propagation.
Ces informations peuvent être amassées pour fournir une vue assez complète des comportements de signalisation du calcium dans les cellules de leur environnement natif. À l’aide de l’analyse des particules, des informations quantitatives sur la signalisation du calcium peuvent être calculées en mesurant la zone des particules et le nombre de particules, qui ensemble peuvent être utilisés pour déterminer les plages spatiales d’activation du signal calcique dans un champ de vision spécifique. L’analyse des particules permet également la quantification en profondeur de la signalisation subcellulaire du calcium par l’examen de l’emplacement et les probabilités de cuisson des sites de cuisson du calcium.
En allouant les particules en différents drapeaux en fonction de leurs caractéristiques temporelles, les particules initiatiques peuvent être cartographiées avec précision. Et une mine de données dures acquises sur le nombre de sites d’initiation, la taille du site en pixels et micromètres, la probabilité que chaque site d’initiation tire une ou plusieurs fois au cours de chaque grappe transitoire de calcium, et le pourcentage de sites de cuisson qui s’en tirent au cours de chaque cycle transitoire de cluster de calcium peuvent être obtenus. La cohérence est la clé du succès de ce protocole.
Tous les ensembles de données et tous les films doivent être traités exactement de la même manière pour garantir des résultats fiables et reproductibles. Cela est particulièrement vrai lorsqu’il s’agit de fichiers de particules. Nos protocoles permettent une caractérisation profonde de la signalisation du calcium in situ, et une gamme de méthodes statistiques, lorsqu’elles sont utilisées de manière appropriée, peuvent évaluer les différences entre une gamme de paramètres spatiaux et temporels.
Ces techniques d’analyse dans notre protocole ont permis aux chercheurs de poser et de répondre à des questions auparavant non adressées concernant le rythme intestinal, et l’innervation intestinale, ainsi que le contrôle neuronal des voies urinaires inférieures.
