Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subventions 2R01 GM53132 et P50 GM071558.

1. Cellules de chargement avec des indicateurs de calcium <ol><li> Cellules de la plaque en 35mm plats en verre MatTek bas (ou tout autre visionnement à fond de verre chambres). </li><li> Si vous utilisez primaires manteau de myocytes les chambres 1 jour avant avec 10μg/ml laminine. Myocytes cardiaques Plate (isolé de chiens adultes, les rats nouveau-nés, ou autre organisme) en Ko de tampon (buffer Tyrode K-retournement 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO3, 2 mmol / L de MgCl 2 et 0,4 mmol / L de KH 2 PO 4, pH 7,5) et le changer progressivement milieu M199 supplémenté avec 15% de sérum bovin fœtal et streptamycin 1% et la gentamicine 0,5% et incuber à 37 ° C dans 5% CO 2. </li><li> Incuber les cellules avec du calcium verte AM (1-5 uM; Molecular Probes) ou tout autre indicateur de calcium désirée pendant 30-45 min à température ambiante. Couvrir le plat avec du papier aluminium pour éviter de photoblanchiment du colorant. </li><li> Laver les cellules trois fois avec Leibovitz15 moyenne avec 14mm EGTA (Si la réalisation d&#39;expériences en calcium faible) ou tout autre support d&#39;affichage appropriée. </li><li> Incuber pendant 30-45 minutes dans une autre Leibovitz15 moyennes containing14mM EGTA. </li><li> Si les tests des effets des inhibiteurs (c&#39;est à dire 10 uM U73122 PLC inhibiteur) les ajouter lors de la seconde incubation. </li></ol> 2. Cellules micro-injection <ol><li> Cardiomyocytes culture dans des boîtes en verre MatTek bas (ou d&#39;autres chambres de visualisation) pour 24h. </li><li> Changer le support en phénol libre Leibovitz-15 avec 14 mM d&#39;EGTA (cardiomyocytes doivent être injectés dans le milieu sans calcium, d&#39;autres cellules peuvent être injectées en calcium contenant du milieu). </li><li> Préparer une solution de micro-injection - nos études a utilisé un peptide qui élimine Ga Q - interactions cavéoles. Gardez à l&#39;esprit que seule une petite quantité de volume est injecté dans la cellule (~ fL) et si les stocks de concentrés raisonnable doit être utilisé. Nous avons utilisé 2 uM de ce peptide, CAV3-échafaudage, avec DAPI dans un milieu sans calcium. DAPI est un blue de teinture qui colore le noyau et permet l&#39;identification des cellules qui ont été microinjectés. DAPI n&#39;interfère pas avec la fluorescence des indicateurs de calcium nombreuses. Le montant de DAPI est variable et nous utilisons généralement assez pour visualiser le noyau (0,5 et 2 M) </li><li> Préparer la solution de contrôle contenant du DAPI - le traceur colorant seul. </li><li> Pour microinjections utiliser des aiguilles auto-tiré ou disponibles commercialement. Pratique avec l&#39;injection de colorant pour déterminer les paramètres à aiguille appropriée. Nous notons que les différentes cellules peuvent exiger diamètres d&#39;aiguilles et des pressions différentes de micro-injection. </li><li> Utilisez le système de microinjection automatisé, par exemple une NI2 InjectMan avec une pompe FemtoJet d&#39;Eppendorf. Régler la pression d&#39;injection P i à 90 hPa et la compensation de pression P C à 45 hPa. Réglez le temps t d&#39;injection à 0,7 s. Réajuster les paramètres de l&#39;injection au besoin. </li><li> Effectuer microinjections sur un microscope inversé (par exemple Zeiss Axiovert 200M) équipé d&#39;objectif à long distance de contraste de phase de travail (par exemple la phase de l&#39;air 40x objectif 2). </li><li> Injecter autant de cellules que possible d&#39;une manière rapide. Examiner les cellules injectées en utilisant le contraste de phase pour sélectionner les cellules viables. </li></ol> 3. Co-immunofluorescence d&#39;études <ol><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS et fixer avec du paraformaldéhyde à 3,7% pendant 30 minutes. Si nécessaire, les cellules peuvent être stimulées avant la fixation. </li><li> Laver les cellules fixes trois fois avec PBS, et incuber avec 0,2% de NP40 dans du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Bloc à l&#39;aide du PBS contenant du sérum de chèvre 4% (ou autre sérum approprié) pour 1 heure. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps primaires à la dilution appropriée avec du sérum de chèvre 1% dans du PBS pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules trois fois pendant 10 minutes avec 150 mM de NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 suivie par l&#39;addition des fluorescents anticorps secondaire marqué, comme Alexa-Fluor-488 anti-lapin ou Alexa-Fluor-647 anticorps anti-souris dilué secondaires à 1: 1000 1% du sérum de chèvre dans du PBS (à noter que lors de palpage pour deux protéines différentes les anticorps primaires doivent être soulevées dans les différentes espèces et le secondaire doit être contre les espèces correspondantes). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1 heure, laver trois fois avec le SCT. </li><li> Voir les cellules dans du tampon TBS ou tout autre support d&#39;affichage appropriée. </li></ol> 4. Imagerie calcique rapide <ol><li> Utilisez microscope confocal à balayage laser (par exemple Fluoview 1000 Olympus). </li><li> Utilisez haute objectif d&#39;ouverture numérique. </li><li> Régler les paramètres d&#39;acquisition. Pour utiliser le calcium nm d&#39;excitation verte 488 et 515 passent à long filtres d&#39;émission. </li><li> Réglez le temps de pixels - pour les mesures de calcium vitesse elle fixée à 2 ms / pixel. </li><li> Réglez le zoom de l&#39;image pour atteindre la taille de pixel de 0,05 à 0,3 um. </li><li> Sélectionnez une ligne dans une cellule de choix dans une région particulière. </li><li> Dans la fenêtre du contrôleur de sélectionner le temps d&#39;acquisition de temps d&#39;au moins 1500 pages (pour obtenir désirée délai dela réponse - 1,3 ms / ligne rapporterait 2 secondes). </li><li> Enregistrement de fond la lecture avant la stimulation. </li><li> Stimuler les cellules avec 5 uM de carbachol et commencez immédiatement à enregistrer des données. Gardez les cellules dans 1 ml de Leibovitz15 moyen, préparer 10 uM dans le carbachol Leibovitz15 et ajouter délicatement 1 mL dans le plat </li></ol> 5. L&#39;analyse des données <ol><li> Extraire les intensités pour chaque pixel de l&#39;image enregistrée. Sauvegarder les données d&#39;intensité comme un tableau en utilisant le logiciel Fluoview 1000. </li><li> Importer des données d&#39;intensité dans les Sigmaplot ou un programme d&#39;analyse des données similaires et ben les données dans ~ 90-40 bacs. Comparer à des expériences de contrôle et de bruit électronique. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Nous imagé cellules sur microscope confocal à balayage laser LSM510 (Zeiss, Jena, Allemagne) équipé d&#39;une excitation laser multi-ligne et un 40x/1.2 Apochromat NA objectif à immersion d&#39;eau. Dans la Fig. 1 (rouge), nous montrent la répartition du pouvoirn des cavéoles dans les cardiomyocytes ventriculaires canins adultes qui ont été fixées et colorées avec un anticorps dirigé contre la cavéoline-3 qui est la principale protéine structurale caveolar dans ces 9 cellules. Cavéoline-3 a été immunomarquées avec Alexa-647 et excité à la ligne 633-nm à partir d&#39;un He: Ne laser. Les images ont été enregistrées à l&#39;aide LP650 filtre d&#39;émission nm. La distribution de la cavéoline-3 a été comparé à Ga q qui a été immunomarquées avec Alexa-488 (vert). Alexa-488 a été excité à 488nm argon-ion de ligne laser et l&#39;image a été enregistrée en utilisant un filtre d&#39;émission BP505-530nm. Dans ces mesures colocalisation, les deux fluorophores sont excités de façon séquentielle à l&#39;aide d&#39;acquisition multi-pistes. Cette procédure minimise la diaphonie de canal. L&#39;analyse des données pour la colocalisation a été réalisée en utilisant le logiciel fourni avec AIM Zeiss LSM510-Meta. Comme on peut le constater, les deux protéines sont colocalisés. Pour déterminer comment le couplage entre la cavéoline-3 et Ga <sub&gt; q affecter les signaux de calcium, nous avons effectué des études d&#39;imagerie calcique sur un système de microscope confocal à balayage laser (Fluoview, Olympus, Tokyo, Japon) couplé à un microscope inversé (IX70, Olympus) avec un objectif 40x (UPlanApo, Olympus, ouverture numérique 1.3), bien que ces mesures pourraient également être effectuées sur les systèmes décrits ci-dessus Zeis. Pour ces mesures, les cellules ont été chargées de Ca 2 + vert. Nous excités du colorant avec un laser 488nm Argon ion et recueilli des images à travers un filtre d&#39;émission LP515. Cadres d&#39;image ont été prélevés à intervalles de 500 ms. Les valeurs d&#39;intensité de chaque pixel ont été extraites à l&#39;aide de logiciels et Olympus ImageJ. Le mode de balayage de ligne a été utilisé pour l&#39;analyse quantitative de la plus rapide de Ca 2 + transitoires et Ca 2 + des étincelles. La taille du pixel utilisé dans la présente étude était de 0.1 à 0.3 um. Le taux de balayage ligne est d&#39;environ plusieurs centaines de ms par ligne. Dans la Fig. 2, nous montrent une ligne de balayage d&#39;une Ca 2 + Green-chargés cardiomyocytes où le pixel dtemps bien est de 2 ms, le temps de la ligne était de 142 ms. L&#39;image est composée de 1200 lignes. Chaque ligne de l&#39;analyse correspond à la fluctuation d&#39;intensité de Ca 2 + vert composé de 71 points pris sur une plage de 142 ms, et peut être utilisé comme une rapide lecture des réponses de calcium. Par exemple, dans la Fig. 3 nous montrons le Ca 2 + activité d&#39;une seule ligne d&#39;un cardiomyocyte individuelles, telle que mesurée par l&#39;intensité de Ca 2 + verte fluorescence en fonction du temps en secondes avant (haut) et après (en bas) l&#39;addition de 5 uM de carbachol qui améliore le niveau intracellulaire de Ca 2 + par le biais Ga-q PLCβ activité. Lorsque plusieurs lignes sont en moyenne, la stimulation carbachol produit une augmentation d&#39;un facteur ~ 1,8 en Ca 2 + intensité de vert. En raison de variations dans les conditions expérimentales (température ambiante, la puissance du laser, la réponse du détecteur, les distributions de teinture, etc), cette augmentation ne peut être vu dans les différentsscans en ligne. Même si les valeurs d&#39;intensité (valeurs de l&#39;axe Y) sont similaires, il est clair que l&#39;intrigue carbachol stimulé sur le fond a des pics beaucoup plus large, correspondant à des niveaux de calcium plus soutenue, que les pics de fluctuation étroite vu avant la stimulation. Cette hausse élargissement et relative de l&#39;intensité obscurcit petits, des oscillations plus lentes. Notre objectif est de mieux discriminer entre ces différents types de fluctuations apparentes de calcium. Un autre exemple de ces variations de calcium rapide est montré dans la Fig. 4. Le graphique supérieur montre la ligne de données brutes pour les cardiomyocytes ventriculaires stimulés (rouge) et une moyenne de 3 traces de ligne est affiché en noir. Pour déterminer l&#39;ampleur que ces fluctuations de calcium ont été médiée par Ga Q - caveoline3 interactions, nous microinjectés un peptide qui déstabilise la cavéoline-3 - Ga interactions q (ie CAV3 peptide) qui élimine le plus de Ca 2 + en cours et ces données sont indiquées en bleu(Nous notons que nous avons soustrait 500 de la CAV3 intensités peptide sorte que les deux traces peuvent être mieux discerner). Nous avons importé les colonnes de données brutes de nos fichiers Excel dans Sigmaplot (Jandel, Inc) et a effectué une analyse de l&#39;histogramme. Dans cette analyse, le nombre d&#39;événements sont regroupés en un nombre égal de cases (poubelles) pour produire un histogramme. La largeur du bin représente un intervalle de temps égaux. Les intensités sont insérés dans le temps différentes lie sorte que la hauteur d&#39;un bac particulier représente le nombre de fois que l&#39;intensité se produit dans la fenêtre de temps particulier. Puisque ce type d&#39;analyse ne dépend que de la collecte de données à la vitesse de balayage la même, de nombreuses traces peuvent être analysés simultanément. De plus, cette analyse n&#39;est pas sensible aux différences de niveaux de colorant, la puissance du laser, etc, et le bruit de fond électronique et se produit à des échelles de temps très rapide et ne sont visibles dans les 1-2 premières poubelles. Le histogra correspondantsms des données brutes dans la Fig. 4 sont représentés sur le bas de la page. L&#39;histogramme des cellules de contrôle sont répartis sur un grand nombre de bacs correspondant à une distribution de temps large, telle que représentée par la ligne rouge (la ligne est de guider l&#39;œil et aucun modèle est supposé). En revanche, les bacs pour la réponse des cellules où la Ga-q CAV3 l&#39;interaction a été perturbé par le peptide sont confinés à une distribution étroite bin suggérant que la présence du peptide élimine les flux plus longue durée. Microinjection d&#39;un peptide de contrôle qui ne perturbe pas Ga-q CAV3 produit un histogramme similaire à ONU-ont injecté des cellules 8. Dans la Fig. 5 nous comparons les fluctuations d&#39;intensité rapide de Ca 2 + verte chez les adultes cardiomyocytes ventriculaires canins (à gauche) et frais, des cardiomyocytes de rat stimulées néonatale que le manque cavéoles (à droite). Ici, les histogrammes correspondants des intensités sur une période de trois minutes ont été supprimés<html> à 35 pour afficher les événements de calcium lent. Notez que les cardiomyocytes néonataux d&#39;affichage des fluctuations rapides sur une base plane montrant le manque de ralentissement de l&#39;activité Ca 2 + alors une base plus structurée est observée pour les cellules adultes. Ces différences sont plus facilement visibles dans les histogrammes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Images Figure 1. Canines des cardiomyocytes ventriculaires adulte montrant la répartition des Ga q immunomarquées avec Alexa-488, où Alexa-488 a été excité à 488nm argon-ion de ligne laser et l&#39;image a été enregistrée en utilisant un filtre d&#39;émission BP505-530nm. Le haut à droite est l&#39;image même visualisation de la localisation des cavéoline-3 immunomarquées avec Alexa-647, excités par la ligne 633-nm à partir d&#39;un Lui:. Ne laser et d&#39;émissions enregistrées à l&#39;aide LP650 nm filtre L&#39;image fusionnée où colocalisation est vu dans l&#39;orange est en bas à gauche avec une image élargie à la droite. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Figure 2. Imagerie calcium d&#39;un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca 2 + vert. L&#39;image a été prise sur un système de microscope confocal à balayage laser avec un objectif 40x en utilisant un laser à ions argon 488nm et un filtre d&#39;émission LP515. L&#39;image est composée de 1200 lignes, le pixel est temps de maintien 2 ms, et la taille du pixel était de 0,1 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Figure 3. Fluctuations d&#39;intensité TOP d&#39;une trace de la ligne à partir d&#39;un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca 2 + Green et imagé comme décrit, et BOTTOM la même cellule stimulée par l&#39;addition de 5 uM de carbachol. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. TOP Un exemple de traces ligne d&#39;un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca 2 + vert (rouge) pris plus de 180 ms, où la moyenne des trois traces est présenté comme une ligne noire, et comparé à une cellule qui a été microinjectés avec un peptide qui perturbe Ga Q-cavéoline 3 association (rouge), où une moyenne de trois traces est en noir. Nous notons que nous avons soustrait 400 points d&#39;intensité de l&#39;ensemble inférieur de données à des fins de visualisation. Les panneaux inférieurs sont les histogrammes correspondants des données mis en cellule comme décrit dans le texte, et où le nombre est arbitraire et ben le nombre de bin (ou simplement compter) correspond à la quantité totale de l&#39;intensité dans cette poubelle particulière. Nous notons que les lignes de la ligne rouge et bleu dessiné dans le contrôle (à gauche) et le peptide (à droite) sont des histogrammes pour permettre une identification plus facile et les comparaisons des données et pas de modèle est supposé. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Fluctuations d&#39;intensité de Ca 2 + verte chez les adultes cardiomyocytes ventriculaires canins (à gauche) et frais, des cardiomyocytes de rat stimulées néonatale que le manque cavéoles (à droite) et leurs histogrammes correspondants sont présentés ci-dessous.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons développé une méthode pour afficher et d&#39;isoler les signaux calciques dans les cardiomyocytes rapide vivants. Alors que les conditions expérimentales de ces mesures ont déjà été appliquée à des systèmes cellulaires 10 autres ainsi que des cardiomyocytes 11, l&#39;utilisation d&#39;histogrammes et de l&#39;analyse permet bin données provenant de nombreuses Ca 2 + des événements devant être acquis. Plus rapide des événements peut être facilement isolé du p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomyocytes ont de multiples flux de Ca 2 + d&#39;une durée variable qui travaillent ensemble pour optimiser 1,2 fonction. Les changements dans l&#39;activité Ca 2 + dans la réponse aux agents extracellulaire est principalement régulée par la phospholipase Cß-Ga voie Q localisés sur la membrane plasmique qui est stimulée par des agents tels que l&#39;acétylcholine 3,4. Nous avons récemment constaté que les domaines plasmatique protéine membranaire appelée cavéoles 5,6 Ga peut piéger activé q 7. Ce piège a pour effet de stabiliser l&#39;état activé de Ga q et entraînant prolongée de Ca 2 + dans les cardiomyocytes des signaux et des autres types de cellules 8. Nous avons découvert ce résultat surprenant en mesurant les réponses de calcium dynamique à l&#39;échelle rapide dans les cardiomyocytes de vie. Brièvement, les cellules sont chargées avec une lampe fluorescente de Ca 2 + indicateur. Dans nos études, nous avons utilisé Ca 2 + Vert (Invitrogen, enc.) qui présente une augmentation de l&#39;intensité d&#39;émission de fluorescence lors de la liaison des ions calcium. L&#39;intensité de fluorescence est ensuite enregistré pour utiliser un mode de balayage ligne d&#39;un microscope confocal à balayage laser. Cette méthode permet l&#39;acquisition rapide de l&#39;évolution temporelle de l&#39;intensité de fluorescence en pixels le long d&#39;une ligne sélectionnée, produire plusieurs centaines de traces du temps sur l&#39;échelle de la microseconde. Ces traces sont très vite transférés dans Excel, puis dans Sigmaplot pour l&#39;analyse, et sont comparés à des traces obtenues pour le bruit électronique, sans colorant, et d&#39;autres contrôles. Pour disséquer Ca 2 + réponses des débits différents, nous avons effectué une analyse de l&#39;histogramme qui binned intensités des pixels avec le temps. Binning nous permet de regrouper plus de 500 traces de scans et de visualiser les résultats compilés spatialement et temporellement sur une même parcelle. Ainsi, les ondes lentes Ca + 2 qui sont difficiles à discerner quand les scans sont superposées due au placement de pointe différentes et le bruit, peut être facilement vu dansles histogrammes binned. Flux très rapide dans l&#39;échelle de temps de la mesure montrent une distribution étroite des intensités dans les bacs très peu de temps alors que les plus vagues Ca 2 + montrent des données mis en cellule avec une large distribution au cours des bacs de temps plus long. Ces distributions de temps différentes nous permettent de disséquer le calendrier de flux de Ca 2 + dans les cellules, et de déterminer leur impact sur ​​les différents événements cellulaires.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d&#39;intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l&#39;enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l&#39;histogramme nous permet d&#39;isoler les échelles de temps des différents flux de calcium.

Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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15.1K vues.  Queensborough Community College. Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d'intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l'enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l'histogramme nous permet d'isoler les échelles de t...

Vidéo: Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Écran génétique avancé utilisant l’aequorin de journaliste transgénique de calcium pour identifier de nouvelles cibles dans la signalisation de calcium

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.