Le dysfonctionnement cardiovasculaire est la principale cause de décès dans le monde. Le modèle cardiaque isolé que nous présentons ici peut servir de fenêtre expérimentale sur la dynamique cardiaque humaine. Cette approche combine une étude classique d’électrophysiologie avec la cartographie optique simultanée de la tension transmembrane et du calcium intercellulaire pour évaluer l’état du cœur.
Cette méthodologie peut être appliquée aux études de modélisation des maladies, de pharmacologie et de toxicologie. Par exemple, l’un de nos domaines d’intérêt est de caractériser les effets des tailleurs de verre sur l’électrophysiologie cardiaque. Bien que cette méthodologie soit plus difficile techniquement qu’un protocole qui utilise un modèle animal plus petit, dans l’ensemble, le protocole est relativement simple une fois que toutes les pièces sont en place.
Il est difficile de décrire tous les composants d’un système d’imagerie et de perfusion par texte, de sorte que la démonstration visuelle de ce processus aidera à reproduire une préparation réussie. Après avoir isolé le cœur avec l’aorte ascendante intacte, plongez l’organe excisé dans une cardioplégie glacée et utilisez une paire d’hémostats pour saisir la paroi de l’aorte. Glissez le récipient sur une canule côtelée fixée à un tube relié à un litre de cardioplégie glacée moyenne suspendue à environ 95 centimètres au-dessus du cœur.
Laissez le fluide remplir l’aorte jusqu’à ce que le récipient déborde pour empêcher les bulles d’entrer dans la vascularisation et utilisez du ruban ombilical pour fixer l’aorte à la canule. Attachez les hémostats pour supporter le poids du cœur pendant qu’il pend de la canule pour fixer davantage le tissu et permettre au milieu froid de rétrograder le cœur à une pression constante de 70 millimètres de mercure par gravité. Transférez l’écoute au système Langendorff à 37 degrés Celsius sans introduire d’air dans la canule.
Et permettre au rythme normal des sinus de rincer la vascularisation de tout sang et cardioplégie restants. En cas d’arythmies chocables, placez des pagaies externes à l’apex et à la base du cœur pour défibriller l’organe, offrant un seul choc à cinq joules et augmentant en cinq incréments de joule jusqu’à ce que 50 joules, cardioversion, ou rythme non choquant est atteint. Puis, rincer le cœur avec au moins un litre de krebs-henseleit modifié moyen sans recirculation pour enlever tout sang résiduel et cardioplégie.
Lorsque le milieu passe à travers le cœur, fermez la boucle de circulation pour recirculer le perfusate. Pour enregistrer un plomb standard à l’ECG tout au long de l’étude, fixez une électrode d’aiguille de calibre 29 à l’epicardium ventriculaire près de l’apex et fixez une autre électrode dans l’atrium droit. Connectez les entrées positives et négatives d’un bioamplificateur différentiel à l’oreillette apex et droite, respectivement, et fixez une électrode bipolaire de stimulus sur l’oreillette droite et une deuxième électrode bipolaire de stimulus au ventricule gauche latéral pour des buts de stimulation.
Rythmez le cœur à l’aide d’un stimulateur d’électrophysiologie, avec le courant initial réglé à deux fois le seuil diastolique et une largeur d’impulsion d’une milliseconde. Pour identifier le seuil de stimulation, appliquez une série d’impulsions de stimulus d’un à deux milliampes avec une largeur d’impulsion d’une milliseconde à des longueurs définies de cycle de stimulation pour assurer une réponse cohérente de stimulus. Effectuez un rythme de stimulation supplémentaire à l’aide d’un train arpentage S1, S1 ou S1, S2.
Diminuez le cycle de stimulation S2 dans le sens des pas de 10 millisecondes jusqu’à ce que le rythme ne se capture pas. Ensuite, montez jusqu’à l’avant-dernière longueur du cycle de stimulation et diminuez la longueur du cycle en intervalles d’une milliseconde pour déterminer la longueur du cycle de stimulation la plus précise avant la perte de capture. Pour établir la période réfractaire efficace ventriculaire, utilisez l’électrode de stimulus sur le ventricule gauche latéral pour identifier l’intervalle S1, S2 le plus court auquel le battement prématuré S2 initie la dépolarisation ventriculaire.
Pour définir la longueur du cycle de Wenckebach, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit pour trouver l’intervalle S1, S1 le plus court auquel une conduction atrioventriculaire en tête-à-tête se propage par la voie normale de conduction. Pour définir le temps de récupération des nœuds sinus, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit pour appliquer un train de rythme S1, S1 et mesurer le délai entre la dernière impulsion dans le train de stimulation et la récupération de l’activité spontanée nœud sinoatrial médiatisé. Pour établir la période réfractaire efficace de nœud atrioventriculaire, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit.
Trouvez l’intervalle de couplage S1, S2 le plus court auquel la stimulation auriculaire prématurée est suivie d’un potentiel hisbundle qui suscite un complexe QRS, signifiant la dépolarisation ventriculaire. Pour la cartographie optique de la tension transmembrane et du calcium intracellulaire, ajoutez d’abord lentement jusqu’à cinq millilitres de colorant de tension fraîchement préparé proximal à la canule aortique suivi de l’ajout lent de colorant de calcium fraîchement préparé. Ensuite, positionner le matériel d’imagerie pour se concentrer sur un champ de vision approprié et connecter la caméra à un poste de travail.
Obtenez des images à l’aide du logiciel sélectionné avec un temps d’exposition de 5 à 2 millisecondes. Et effectuer un alignement d’image à l’aide d’un logiciel qui peut diviser et superposer les régions désirées et afficher une soustraction à échelle grise ou un ajout pseudo-couleur à tout désalignements de surbrillance. Avec l’éclairage ambiant minimisé, testez les lumières LED pour assurer un éclairage épicurien uniforme et maximum, tel que déterminé par la profondeur du puits du capteur.
Ensuite, imagez le myocarde pendant le rythme des sinus, la fibrillation ventriculaire ou le rythme dynamique à l’aide de l’électrode de stimulation positionnée sur le ventricule gauche, en commençant par une longueur de cycle de stimulation de 350 millisecondes et en diminuant de 10 à 50 millisecondes pour générer des courbes de restitution. Pour confirmer l’acquisition d’un signal optique de qualité tout au long de l’expérience, ouvrez un fichier vidéo, sélectionnez une région d’intérêt et tracez la fluorescence moyenne au fil du temps. À la fin de l’expérience, retirez le cœur du système et égouttez le perfusate.
Rincez ensuite le tube du système et les chambres à l’eau purifiée. Pour l’entretien courant, rincez périodiquement le système avec une solution détergente au besoin. Dans ces études représentatives, la procédure a été exécutée sur des modèles intacts, comme démontré, qui ont illé dans la taille de 2.5 à 10.5 kilogrammes de poids corporel et 18 à 137 grammes de poids cardiaque.
Après avoir transféré le cœur isolé à un système Langendorff, la fréquence cardiaque se stabilise à environ 70 battements par minute dans les 10 minutes suivant la défibrillation et reste constante tout au long de la durée de l’étude. Un débit moyen d’environ 184 millilitres par minute est généralement mesuré. Il ralentit à 70 millilitres par minute après perfusage avec milieu réchauffé contenant un découpler mécanique.
Deux ECG de plomb peuvent être enregistrés tout au long de l’étude pendant le rythme des sinus ou en réponse à un rythme externe pour quantifier les paramètres électrophysiologiques. Des expériences de cartographie optique peuvent également être réalisées pendant le rythme des sinus et la fibrillation ventriculaire spontanée. Des images représentatives d’un cœur chargé de teinture peuvent être obtenues avec les potentiels d’action optique correspondants.
Et les transitoires de calcium peuvent être recueillis à partir de deux régions d’intérêt sur la surface épicurienne. En outre, le rythme épidardial dynamique peut être employé pendant les expériences optiques de cartographie pour normaliser n’importe quelle légère différence dans les fréquences cardiaques intrinsèques. Les signaux bruts peuvent être utilisés pour décrire le temps de couplage transitoire de calcium potentiel d’action, le temps d’activation et de durée, et la restitution électrique et de calcium.
Il est important d’éviter de permettre aux bulles d’entrer dans l’aorte, de minimiser le temps de transfert de l’animal au système, et de soutenir le cœur plus grand. Les données d’électrophysiologie et de signaux optiques peuvent être analysées après l’acquisition. En outre, le coeur peut être préservé après l’étude pour l’histologie, l’immunostaining, ou l’analyse d’expression de gène.
Nous utilisons cette technique pour caractériser le développement cardiaque juvénile et pour examiner l’impact des expositions environnementales sur la physiologie cardiaque. Les découplers mécaniques utilisés pour minimiser le mouvement et les produits chimiques anti-mousse utilisés pour lutter contre la mousse d’albumine sont tous deux toxiques, de sorte que l’utilisation de l’équipement de protection individuelle approprié est absolument essentielle.
